SELEX技術(shù)詳解課件

SELEX技術(shù)馮俊奎Introduction單克隆抗體技術(shù)

將產(chǎn)生抗體的單個(gè)B淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞雜交，獲得既能產(chǎn)生抗體，又能無(wú)限增殖的雜種細(xì)胞，并以此生產(chǎn)單克隆抗體。單克隆抗體單克隆抗體作為蛋白質(zhì)，具有特定的空間結(jié)構(gòu)，基于此空間結(jié)構(gòu)其與底物結(jié)合具有特異性、多樣性和定向性，使其在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、蛋白質(zhì)的提純、腫瘤的導(dǎo)向治療等多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。正是由于抗體蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性和特異性決定了單克隆抗體的廣泛應(yīng)用RNA結(jié)構(gòu)的多樣性

RNA分子中除G-C、A-U堿基配對(duì)外,還有G-U等變偶?jí)A基對(duì)的存在,可以形成發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聯(lián)體等空間結(jié)構(gòu),即使一段很小的RNA分子也能形成具有相當(dāng)剛性的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

IntroductionIntroduction

多達(dá)1014個(gè)以上的隨機(jī)寡核苷酸幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象,基于核酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)，核酸配體可以高親和力的結(jié)合于從單個(gè)小分子到復(fù)雜分子再到完整的生物細(xì)胞核組織的廣泛靶目標(biāo)。SELEX技術(shù)的誕生（1990年）

Ellington和Szostak報(bào)道了能夠特異性結(jié)合于染料小分子的RNA配體，并創(chuàng)造了適配體（aptamer）這個(gè)名詞，以指代核酸配體。Tuerk和Gold描述了針對(duì)T4DNA聚合酶適配體的篩選，提出并命名了SELEX技術(shù)。SELEXtechnology

Systematic

EvolutionofLigandsby

ExponentialEnrichment，SELEX

即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)

利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體。SELEXtechnology1.SELEX技術(shù)主要內(nèi)容

SELEX技術(shù)的基本思想是體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù),用它與靶物質(zhì)混合,形成靶物質(zhì)—核酸的復(fù)合物,洗掉未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸,分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸,以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再進(jìn)行下輪的循環(huán)篩選過(guò)程。通過(guò)重復(fù)的篩選與擴(kuò)增,最后得到與靶物質(zhì)具有高親和力與高特異性的適體。SELEXtechnologySELEXtechnology自1990年以來(lái)，SELEX技術(shù)所用作的靶物質(zhì)種類不斷增加。2.SELEX的靶物質(zhì)無(wú)機(jī)離子Zn2+Ni2+有機(jī)小分子乙醇胺茶堿有機(jī)染料膽酸等核苷酸類腺嘌呤ATPcAMP黃嘌呤等輔酶因子輔酶A生物素FMNFAD等核酸E.coli5SRNA酵母苯丙氨酸t(yī)RNA等氨基酸L-纈氨酸D-色氨酸等糖類幾丁質(zhì)交聯(lián)葡聚糖等抗生素卡那霉素A、B鏈霉素等多肽蛋白質(zhì)類HIV-I整合酶HGF鏈霉親和素等復(fù)雜結(jié)構(gòu)炭疽孢子核糖體蛋白PC12cell等SELEXtechnologySELEX技術(shù)對(duì)靶物質(zhì)的要求

SELEX可以用于眾多不同的靶物質(zhì)，讓人們不禁想到適配子的選擇可能用于所有的物質(zhì)。事實(shí)并非如此，SELEX技術(shù)對(duì)靶物質(zhì)也存在一些要求。比如單分子靶物質(zhì)要求高純度，以減少非特異性結(jié)合，非極性強(qiáng)和不帶電的物質(zhì)篩選困難等。SELEXtechnology3.隨機(jī)DNA寡聚核苷酸文庫(kù)的構(gòu)建SELEX首先根椐分子生物學(xué)技術(shù)，人工合成單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)。通常文庫(kù)容量為1014一1015個(gè)單鏈寡核苷序列。庫(kù)的兩端是固定序列作為PCR擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，中間為隨機(jī)序列，隨機(jī)序列長(zhǎng)度在20-80nt。若是篩選RNA，庫(kù)5’端要加上T7啟動(dòng)子序列和反義引物，使庫(kù)能翻譯為RNA庫(kù)和反轉(zhuǎn)錄用于PCR擴(kuò)增。SELEXtechnology文庫(kù)中隨機(jī)序列的長(zhǎng)短影響SELEX篩選的結(jié)果，要根據(jù)靶物質(zhì)的大小性質(zhì)選擇合適的隨機(jī)長(zhǎng)度，太長(zhǎng)太短都不好。

有的研究人員初期合成大量的庫(kù)，中間重復(fù)篩選時(shí)不再進(jìn)行擴(kuò)增，減少DNA合成時(shí)產(chǎn)生的有害產(chǎn)物。

人們可以對(duì)核酸庫(kù)進(jìn)行修飾以探索新的特性、增加庫(kù)的穩(wěn)定性或者增加對(duì)核酸酶的抗性。SELEXtechnology4.篩選過(guò)程

篩選過(guò)程包括，庫(kù)與靶物質(zhì)混合，除去未與靶物質(zhì)結(jié)合的寡核苷酸，洗脫與靶物質(zhì)結(jié)合的寡核苷酸三個(gè)步驟。

旨在從隨機(jī)庫(kù)中篩選出與靶物質(zhì)高親和力和特異性結(jié)合的寡聚核苷酸。SELEXtechnology如何分離得到與靶物質(zhì)相結(jié)合的寡核苷酸鏈?zhǔn)呛Y選過(guò)程的關(guān)鍵。

4.1硝酸纖維素（NC)法將共育的混合物經(jīng)NC膜用真空抽吸過(guò)濾，與靶分子結(jié)合的寡核苷酸序列留在濾膜上，而未結(jié)合靶分子的寡核苷酸序列可被濾掉。經(jīng)洗滌、剪碎濾膜，洗脫、乙醇沉淀等回收結(jié)合的寡核苷酸序列。該法操作簡(jiǎn)單、成本低，無(wú)需特殊設(shè)備。但不能應(yīng)用于較小的靶分子，且對(duì)有豐富構(gòu)象的隨機(jī)寡核苷酸序列有較強(qiáng)的背景吸附。SELEXtechnology4.2親和柱法

靶物質(zhì)與親和柱里的瓊脂珠進(jìn)行交叉連接。與靶物質(zhì)結(jié)合的寡核苷酸序列就吸附在瓊脂珠上，而未結(jié)合的寡核苷酸序列則濾過(guò)，再用高鹽溶液洗脫結(jié)合的寡核苷酸序列，然后進(jìn)行回收。

親和柱法是一種有效的分離方法，適合于不能用NC膜分離的小分子物質(zhì)。SELEXtechnology4.3磁珠法將靶物質(zhì)結(jié)合到磁珠上，利用磁珠篩選。

分離法需要的靶分子少，能快速高效的分離結(jié)合或未結(jié)合的寡核苷酸序列，操作更為簡(jiǎn)單。4.4微孔板法將靶分子固定在微孔板上，用小牛血清封閉其余的位點(diǎn)，然后加入隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)共育，之后通過(guò)簡(jiǎn)單洗滌即可除去未結(jié)合的寡核苷酸序列，洗脫回收結(jié)合的寡核苷酸序列。

該法操作簡(jiǎn)單，成本低。但篩選效率不高。SELEXtechnology4.5凝膠阻滯電泳法

凝膠阻滯電泳法主要通過(guò)核酸和蛋白質(zhì)的分子大小和電荷數(shù)把結(jié)合和未結(jié)合蛋白質(zhì)的核酸分開(kāi)。

但是分離后還要進(jìn)行切膠回收，不穩(wěn)定的回收效率常使寡核苷酸序列損失過(guò)大。SELEXtechnology4.6毛細(xì)管電泳法

其原理主要未結(jié)合的寡核苷酸序列電泳時(shí)的遷移速度比結(jié)合的快。

毛細(xì)管電泳由于分辨率極高，可以高效快速的篩選。毛細(xì)管電泳把SELEX篩選由常規(guī)的8-12輪減少到2-4輪，其篩選時(shí)間由幾周減少到幾天，有良好前景。但也存在一些缺點(diǎn)，分離量少，不同靶分子的電泳條件也需要優(yōu)化，而且對(duì)不能引起較高的電泳遷移率的靶分子如一些小分子、細(xì)胞等的分離效率低下。SELEXtechnology5.擴(kuò)增在此過(guò)程中，篩選出的DNA適配子直接通過(guò)PCR擴(kuò)增。

RNA適配子要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA庫(kù)，再用作下次篩選。SELEXtechnologySELEXtechnology6.ssDNA分離從PCR產(chǎn)物中分離單鏈DNA用于下輪篩選。

7.分子克隆與表征當(dāng)篩選循環(huán)中已富集寡核苷酸庫(kù)的親和力不在增加的時(shí)候，一般在6-20個(gè)篩選循環(huán)后，靶物質(zhì)獨(dú)特的適配子就篩選出來(lái)了。一般情況下，我們對(duì)50個(gè)或更多的篩選出來(lái)的克隆進(jìn)行測(cè)序和序列分析。將他們?cè)敿?xì)分類。對(duì)這些獨(dú)特序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，可以得到相關(guān)的結(jié)構(gòu)和結(jié)合信息。隨后展開(kāi)對(duì)靶物質(zhì)結(jié)合親和力和靈敏度的研究，并最終用于實(shí)際應(yīng)用。SELEXtechnology

SELEX的后期修飾既可以增加適配子的穩(wěn)定性，又可以鞏固其與靶物質(zhì)或相關(guān)分子的結(jié)合參數(shù)。

并且為了進(jìn)一步應(yīng)用，增加了功能集團(tuán)的后期修飾適配子可以用于檢測(cè)和固定靶物質(zhì)。Post-SELEXmodifications

醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的基礎(chǔ)研究、臨床診斷和治療，適配子開(kāi)始與抗體競(jìng)爭(zhēng)成為治療劑。適配體相比于抗體在一般條件下更適合腫瘤導(dǎo)向和體內(nèi)成像。

免疫診斷學(xué)，基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，開(kāi)發(fā)了酶聯(lián)寡核苷酸分析。用于分析系統(tǒng)的分子檢測(cè)。在生物傳感器方面適配體會(huì)成為出色的受體。

FieldsofapplicationsofaptamersAdvantages

庫(kù)容量大，適應(yīng)范圍廣泛；對(duì)靶無(wú)限制小，包括未知結(jié)構(gòu)靶物質(zhì)。

高分辨率。能很好的區(qū)分靶物質(zhì)和其類似物。

高親和力。親和力甚至高于靶物質(zhì)的天然結(jié)合物。

相比于抗體的體內(nèi)篩選，SELEX篩選過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)。

Advantagesandlimitations適配子的變性和復(fù)性快速、可逆，可重復(fù)使用、長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸，相對(duì)抗體和其它蛋白分子具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

適配子體積小。作為藥物給藥時(shí)只產(chǎn)生很低的免疫源性，對(duì)腫瘤穿透力強(qiáng)，而且體內(nèi)易清除?？山⒆詣?dòng)化SELEX。篩選可進(jìn)行多種改進(jìn)滿足不同需求。Advanta