艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法

HIV-1耐藥及耐藥檢測(cè)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院艾滋病研究所張旻

HIV病毒模式圖HIV病毒顆粒由基因組RNA、外膜蛋白Env、衣殼蛋白Gag、逆轉(zhuǎn)錄酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN組成HIV生活周期吸附－穿入－脫殼－生物合成－組裝成熟和釋放HIV基因組模式圖我國(guó)及國(guó)際兩種不同抗HIV治療方案效果比較治療方案國(guó)內(nèi)治療病毒抑制效果國(guó)際治療病毒抑制效果平均治療時(shí)間(月)載量<LDL例數(shù)總例數(shù)病毒抑制率(%)AZT+ddI+NVP7.5197027.1%a45%d4T+ddI+NVP3.910613876.8%b85%注：上標(biāo)字母相同表示組間無(wú)顯著差異，上標(biāo)字母不同表示組間差異顯著項(xiàng)目周期:五年,2005年7月-2010年6月。第一期兩年，2005年7月-2007年6月．全球基金將根據(jù)第一期執(zhí)行情況確定后三年的投入。項(xiàng)目實(shí)施地區(qū)：廣西、貴州、湖南、江西、四川、新疆、云南７個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)），35個(gè)地(州、市），76個(gè)項(xiàng)目縣（市、區(qū)）。178云南63江西95湖南105貴州7635合計(jì)115新疆104四川135廣西縣（市、區(qū)）地(州、市)項(xiàng)目省

總經(jīng)費(fèi)預(yù)算：五年總經(jīng)費(fèi)為9807萬(wàn)美元,其中全球基金支持約6374萬(wàn)美元,中國(guó)政府配套約3433萬(wàn)美元.配套比例逐年增加，由第一年的20%，增加到第五年的50%。

兩年經(jīng)費(fèi)預(yù)算：二年預(yù)算約為3100萬(wàn)美元,其中全球基金支持約2400萬(wàn)美元,中國(guó)政府配套約700萬(wàn)美元.

。

全球基金支持經(jīng)費(fèi)配套經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目總經(jīng)費(fèi)廣西3,605,6091,060,6364,666,245貴州2,365,191697,4453,062,636湖南2,487,791724,4503,212,241江西1,735,176506,2112,241,387四川2,623,645771,1363,394,781新疆3,137,663922,7394,060,402云南4,470,6641,310,9545,781,618中央3,511,1781,002,3204,513,498合計(jì)23,936,9176,995,89130,932,808目標(biāo)六：建立服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，確保針對(duì)艾滋病病人/感染者開(kāi)展的治療、關(guān)懷和支持等活動(dòng)的開(kāi)展，包括母嬰阻斷?；顒?dòng)：在項(xiàng)目省建立和運(yùn)轉(zhuǎn)耐藥監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室,開(kāi)展耐藥監(jiān)測(cè)工作,幫助擴(kuò)展和改進(jìn)國(guó)家耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)各省省級(jí)建立實(shí)驗(yàn)室定為哨點(diǎn)的項(xiàng)目縣按方案采集血樣需要了解的主題:

什么是耐藥性?

藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制?

與病毒的哪些基因有關(guān)?

耐藥性是怎么產(chǎn)生的?

那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?

耐藥性分類與耐藥機(jī)制。

如何檢測(cè)耐藥株?

檢測(cè)中注意事項(xiàng)。什么是HIV耐藥性?

HIV耐藥性是指病毒通過(guò)自身的遺傳變異，產(chǎn)生對(duì)藥物抑制作用，使藥物敏感性降低或不敏感的現(xiàn)象。什么是HIV耐藥性?藥物濃度病毒抑制率(%)野生型病毒耐藥株1000IC50,WTIC50,MT50耐藥倍數(shù)IC50=50%抑制濃度藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制?藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制：全國(guó)艾滋病定點(diǎn)醫(yī)院檢測(cè)技術(shù)研討班AntiretroviralDrugs2004

NRTIs

NNRTIs PIsZidovudine

Nevirapine* SaquinavirDidanosine

Delavirdine

RitonavirStavudine

Efavirenz* IndinavirLamivudine*

Nelfinavir*Zalcitabine

AmprenavirAbacavir

Lopinavir/r

Combivir

AtazanavirTrizivir

FosamprenavirDidanosineECStavudineSR FTC NucleotideRTITenofovirEntryInhibitorsT20 藥物的作用靶點(diǎn)與機(jī)制：藥物作用機(jī)制核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑被靶細(xì)胞的細(xì)胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式與天然三磷酸競(jìng)爭(zhēng)，從而參與病毒DNA的合成，由于該抑制劑經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，將導(dǎo)致病毒DNA鏈合成終止。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是一組結(jié)構(gòu)多樣化的化合物，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性的方式結(jié)合于或者接近于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性位點(diǎn)，從而抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。蛋白酶抑制劑肽類似物，通過(guò)接合于病毒蛋白酶的活性位點(diǎn)來(lái)抑制酶的活性，使之不能將病毒合成的多聚前體蛋白水解為病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和酶的組成部分。耐藥性是怎么產(chǎn)生的?

病毒自身因素—內(nèi)因藥物的選擇壓力—外因耐藥性是怎么產(chǎn)生的?

病毒自身因素—內(nèi)因—HIV-l的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在復(fù)制過(guò)程中，病毒核酸表現(xiàn)出高度的錯(cuò)誤傾向性。

—在病毒的高速?gòu)?fù)制過(guò)程中，高頻率突變?cè)诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)隨時(shí)發(fā)生。

每個(gè)復(fù)制周期產(chǎn)生一個(gè)突變點(diǎn)；

每天產(chǎn)生109

–1010

個(gè)新病毒；

病毒基因組中平均每個(gè)堿基每天突變一次耐藥性是怎么產(chǎn)生的?藥物的選擇壓力—外因—在藥物選擇壓力下，耐藥變異株完全取代藥物敏感株最快能發(fā)生在14至28天內(nèi)?！癢ild”typevirus

(drugsusceptible)“Mutant”virus

(drugresistant)DrugPressureTIMEViralDynamicsandDrugResistanceViralLoad&ReplicationRateViralLoad&ReplicationRateTIMELowReplicationRate&ViralLoadLess“fit”virusPressure:DrugAPressure:DrugBPressure:DrugC,....(Combined)UseofActiveAntiretroviralAgents耐藥性是怎么產(chǎn)生的?—耐藥株是在病毒自發(fā)性的、高頻率的基因突變中產(chǎn)生，在藥物選擇性的壓力下優(yōu)勢(shì)復(fù)制的結(jié)果。那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?病毒載量耐藥株出現(xiàn)時(shí)間300,0000.130,00013,00010300100301,0001.那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?病毒學(xué)失敗率(%)020406080100>9590-9580-9070-80<70服藥依從性

(%)82.171.466.754.621.72.那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?服藥依從性

(%)2.那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?藥物配伍不當(dāng)—藥代顯著不同藥物配伍3.024483612時(shí)間(小時(shí))藥物濃度潛在病毒復(fù)制區(qū)IC90IC50最后一次用藥

第一天第二天單藥治療S.Tayloretal.11thCROIAbs131那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?—細(xì)胞周期依賴性藥物AZT,D4T(活化期細(xì)胞)DDI(靜止相細(xì)胞)蛋白酶抑制劑(活化期細(xì)胞)—非細(xì)胞周期依賴性藥物3TC,FTC,AbacavirTenofovirNNRTIs3.藥物配伍不當(dāng)—缺乏對(duì)某一時(shí)相細(xì)胞內(nèi)病毒抑制或抑制不足那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)?—胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉；—隨意間歇服藥；—與中藥或其他藥物同時(shí)服用。4.其他因素什么是好治療方案?—能快速抑制病毒；—不易產(chǎn)生耐藥性；—可長(zhǎng)期維持；耐藥性分類1、原發(fā)性耐藥(Primaryresistance):病人在接受抗病毒治療前產(chǎn)生了藥物作用靶點(diǎn)的變異，或者感染了耐藥毒株，均降低抗病毒藥物的敏感性。在已經(jīng)開(kāi)展HAART的國(guó)家普遍存在，感染了耐藥毒株的病人很容易引起藥物治療失敗。2、繼發(fā)性耐藥(Secondaryresistance):病人已經(jīng)接受了抗病毒治療并產(chǎn)生治療失敗，在藥物的選擇壓力下產(chǎn)生的耐藥。耐藥機(jī)制：

核苷和核苷類似物1、破壞核苷類似物結(jié)合病毒DNA的能力

M184V突變:RT酶第184位密碼子的氨基酸由蛋氨酸(M)變成為纈氨酸(V)

。拉米夫定(Lamivudine)Q151Mmutation:在HIV-1中出現(xiàn)低于

5%；HIV-2中出現(xiàn)頻率較高。耐藥機(jī)制：2、切除病毒DNA鏈末端的核苷類似物Thymidineanaloguesmutations:突變引起ATP或者焦磷酸介導(dǎo)的切除DNA鏈3‘末端核苷類似物。核苷和核苷類似物耐藥機(jī)制：非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)

突變降低了抑制劑對(duì)酶的結(jié)合力。不同于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其單一突變就能導(dǎo)致高度耐藥。如K103N、Y181C。耐藥機(jī)制：K103N突變的機(jī)制耐藥機(jī)制：蛋白酶抑制劑

HIV蛋白酶由兩個(gè)同樣的蛋白質(zhì)鏈組成。這兩個(gè)蛋白質(zhì)鏈在一起就如同核桃的兩半，而蛋白酶的活性位點(diǎn)就在兩個(gè)半殼的中間。

突變點(diǎn)的表示方法：

基因的突變通常以字母－數(shù)字－字母的書(shū)寫(xiě)方式來(lái)表示，第一個(gè)字母代表野生型病毒株特定密碼子處的氨基酸，第二個(gè)字母代表在特定密碼子處替換了的氨基酸，中間數(shù)字表示突變點(diǎn)的位置。例如：逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）K103N的突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第103位密碼子的氨基酸由天冬酰胺（K）變成為賴氨酸（N）。如何檢測(cè)耐藥株：

目前耐藥性檢測(cè)有兩種方法，即表型檢測(cè)及基因型檢測(cè)。表型檢測(cè)通過(guò)用藥期間的病毒培養(yǎng)進(jìn)行，而基因型檢測(cè)則通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變?；蛐蜋z測(cè)的費(fèi)用較低，技術(shù)也相對(duì)容易，可在樣品收集后1～2周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢測(cè)時(shí)，需要掌握大量相關(guān)知識(shí)，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交叉耐藥等，才能對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確的分析。表型檢測(cè)可以直接檢測(cè)病毒的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前國(guó)際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測(cè)。如何檢測(cè)耐藥株：TranslationintolinearstringofaminoacidsFoldingintofunctionalproteinHIVRNA表型檢測(cè)基因型檢測(cè)基因型和表型檢測(cè)檢測(cè)中注意事項(xiàng):—在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保證耐藥株占總病毒量的20%以上；—病毒載量<1000時(shí),可出現(xiàn)假陰性。我國(guó)HIV耐藥性本底抽樣調(diào)查結(jié)果

1)對(duì)于RT基因區(qū)共完成對(duì)21個(gè)省區(qū)共143個(gè)樣本的測(cè)序，僅有2例發(fā)現(xiàn)具有輕微耐藥（占總樣本數(shù)的1.4%）

2)對(duì)于蛋白酶基因區(qū)本次調(diào)查共完成20個(gè)省區(qū)168個(gè)樣本的分析，僅發(fā)現(xiàn)有2例樣本（占總樣本數(shù)1.21%）具有輕微耐藥。 結(jié)論：當(dāng)前我國(guó)HIV耐藥性處于較低狀態(tài)，對(duì)于幾乎所有藥物敏感，我國(guó)抗HIV藥物的使用如果有計(jì)劃的開(kāi)展，應(yīng)當(dāng)會(huì)有較好的效果，但應(yīng)加強(qiáng)治療依從性促進(jìn)工作和耐藥毒株的監(jiān)測(cè)工作。HIV基因型耐藥性檢測(cè)

（序列測(cè)定法）檢測(cè)流程病人血漿標(biāo)本HIVRNA病毒cDNAHIVRT和PR基因片段序列測(cè)定結(jié)果解釋RNA提取逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增特定的解釋系統(tǒng)標(biāo)本新鮮EDTA抗凝血漿，或-80℃保存，避免反復(fù)凍融病毒RNA提?。≦iagen公司試劑盒）裂解標(biāo)本，滅活RNA酶加到離心柱中，RNA與硅膠膜結(jié)合洗兩次，去除雜質(zhì)用無(wú)RNA酶的緩沖液洗脫RNA收集RNA備用優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、得率高逆轉(zhuǎn)錄RNAcDNA

反應(yīng)體系：

10XBuffer1l

dNTP0.5l

外側(cè)反向引物1l

RNaseinhibitor0.25lM-MuLVRT0.25lDEPC水2lRNA模板5l42℃水浴1小時(shí)，95℃5分鐘滅活RT巢式PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系：

10XBuffer5lMgCl23l

dNTP1l

外側(cè)正向引物1l

外側(cè)反向引物1l

Taq酶0.5l

水29.5l

cDNA模板10l

94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循環(huán)巢式PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因第二輪擴(kuò)增反應(yīng)體系：

10XBuffer5lMgCl23l

dNTP1l

內(nèi)側(cè)正向引物1l

內(nèi)側(cè)反向引物1l

Taq酶0.5l

水29.5l

第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物10l

94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物純化QIAquickGelextraction試劑盒核酸序列測(cè)定雙脫氧鏈末端終止法:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA利用網(wǎng)絡(luò)工具確定耐藥性突變并進(jìn)行耐藥性解釋

Web站點(diǎn)：http://

HIVDrugResistanceAlgorithm2

HIVDrugResistanceAlgorithm3

HIVDrugresistancedatabase

HIVDrugResistanceAlgorithm1高度耐藥：大于60分中度耐藥：30－59分低度耐藥：15－29分潛在低度耐藥：10－14分敏感：0－9分耐藥性突變計(jì)分HIV-1耐藥性檢測(cè)的臨床指征：（1）抗病毒治療病毒學(xué)失敗需要改變抗病毒治療方案時(shí)應(yīng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)以協(xié)助選擇有效的抗病毒藥物。（2）抗病毒治療病毒載量下降不理想時(shí)可進(jìn)行HIV-1的耐藥性檢測(cè)。（3）抗病毒治療失敗需要進(jìn)行耐藥性檢測(cè)時(shí)，應(yīng)該在病人仍在服藥時(shí)或停藥后立即（4周內(nèi)）進(jìn)行檢測(cè)。HIV-1耐藥性檢測(cè)的臨床指征：（4）急性HIV－1感染的病人進(jìn)行抗病毒治療，最好進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，對(duì)于選擇合適的抗病毒藥物、取得最佳抗病毒效果很有益處。（5）對(duì)于未經(jīng)抗病毒治療的慢性HIV感染者不一定要做耐藥性檢測(cè)，但當(dāng)有跡象顯示感染的是耐藥性HIV毒株時(shí)（例如感染來(lái)自于正在服用抗病毒藥物的病人），就應(yīng)當(dāng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。（6）不推薦對(duì)病毒載量<1000cp/ml的病人做病毒載量檢測(cè)，因?yàn)椴《舅教秃茈y擴(kuò)增出目的基因片段

耐藥性檢測(cè)結(jié)果的解釋

HIV-1的耐藥性不是全或無(wú)的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性檢測(cè)結(jié)果的分析和解釋都有困難

所有抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的，即對(duì)一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他藥物的抗病毒活性。

藥物即使有耐藥性也可能有益處，因?yàn)橛心退幮酝蛔兊牟《颈让舾卸局甑膹?fù)制適應(yīng)性要差得多。

血清中藥物的水平，特別是蛋白酶類藥物是高度變化的，如果能夠提高血清中蛋白酶類藥物的濃度，低水平的蛋白酶耐藥性有時(shí)能夠被克服。NucleosideResistanceMutationsZidovudine 41,67,70,210,215,219(TAMs)Didanosine 65,74,75,184Zalcitabine 65,69,74,184Stavudine 41,67,70,75,210,215,219(TAMs)Lamivudine 184Abacavir 41,65,67,70,74,115,184,210,215,219MultinucleosideResistanceMultipleTAMs 41,67,70,210,215,21969insertioncomplex 41,62,67,69,70,210,215,219151complex 62,75,77,116,151NNRTIResistanceMutationsNevirapine 100,103,106,108,181,188,190,230Delavirdine 103,181,230,236Efavirenz 100,103,108,188L,190,225,230ProteaseResistanceMutationsIndinavir 10,20,24,46,63,64,82,84,90Nelfinavir 30,35,36,46,71,84,88,90Ritonavir 8,10,20,33,36,54,63,71,82,84,90Saquinavir 10,24,30,46,48,54,63,64,71,73,77, 81,84,88,90Amprenavir 10,32,46,47,50V,54