綠膿桿菌檢驗(yàn)技術(shù)課件

化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonas

aeruginosa）

的檢測1可編輯課件PPT目的：

1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測的基本過程。2.掌握幾種培養(yǎng)基的配置方法。3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。原理：

銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落大小不一，平均直徑2mm～3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態(tài)。氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產(chǎn)生氮?dú)?，?2℃條件下可以生長，可與類似菌區(qū)別。2可編輯課件PPT操作步驟

檢樣前化妝品的處理

接樣于營養(yǎng)肉湯增菌，37℃，12h，140rpm培養(yǎng)分離培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物接于十六烷基三甲基溴化銨平板，37℃，18-24h

染色鏡檢

配十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制）配綠膿菌素測定用培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面培養(yǎng)基3可編輯課件PPT操作步驟特征性檢驗(yàn)氧化酶綠膿菌素硝酸鹽還原明膠液化42℃生長試驗(yàn)試驗(yàn)產(chǎn)氣試驗(yàn)試驗(yàn)試驗(yàn)取菌+1滴接菌，37℃接菌接菌接菌二甲基對24h+氯仿37℃24h37℃24h42℃24h苯二胺移出+鹽酸紫紅色（+）紫紅色（+）有氣體（+）溶解成液狀（+）生長（+）不變色（-）不變色（-）無氣體（-）未溶解（-）不生長（-）4可編輯課件PPT實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的制備及細(xì)菌的分離培養(yǎng)

5可編輯課件PPT實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆张囵B(yǎng)基制備的原理和方法掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)了解滅菌方法6可編輯課件PPT實(shí)驗(yàn)原理

不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件，在實(shí)驗(yàn)室中，微生物的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基來提供的。培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。

除營養(yǎng)條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才表現(xiàn)出最大生命力，因此，應(yīng)針對不同的微生物將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到適當(dāng)范圍。

7可編輯課件PPT操作步驟按培養(yǎng)基

配方稱量加水加

熱熔化調(diào)節(jié)

pH值分裝

包裝滅菌備用→8可編輯課件PPT操作步驟1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓制成斜面2.明膠培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓直立制成高層3.硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝有小倒管的試管高壓直立制成高層4.普通瓊脂斜面培養(yǎng)基300ml加熱溶解調(diào)pH分裝試管高壓制成斜面9可編輯課件PPT注意事項(xiàng)培養(yǎng)基溶解時(shí)，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。加熱后應(yīng)補(bǔ)足液量。注意做好標(biāo)記。10可編輯課件PPT細(xì)菌的分離培養(yǎng)原理：通過劃線，將混雜的細(xì)菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落(colony)。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個(gè)菌落，移種培養(yǎng)后，即得到純種細(xì)菌。11可編輯課件PPT方法：平板劃線法有幾種，可根據(jù)不同情況選用其中一種。(1)平行劃線法此法適用于含菌不多的液體標(biāo)本，如腦脊液(CSF)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。①左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標(biāo)本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。②將平板轉(zhuǎn)180°角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37℃培養(yǎng)。12可編輯課件PPT(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標(biāo)本，如糞便，喀痰、細(xì)菌固體培養(yǎng)物等。①劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標(biāo)本涂開并在平板的1/5～1/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。②將平板轉(zhuǎn)約70°角，待接種環(huán)冷卻后，使接種環(huán)通過已劃線的1區(qū)5～7次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過火焰滅菌。③再轉(zhuǎn)平板約70°，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。④重復(fù)上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37℃培養(yǎng)。13可編輯課件PPT實(shí)驗(yàn)二染色鏡檢及五項(xiàng)指標(biāo)試驗(yàn)

14可編輯課件PPT革蘭氏染色方法涂片→干燥→固定→染色→鏡檢1．涂片：取一潔凈的載玻片，用記號(hào)筆在載玻片做好標(biāo)記，并在載玻片中間滴一小滴生理..鹽水，以無菌接種環(huán)挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。

為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細(xì)菌。2．干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦。3．固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過三次，以固定之。此時(shí)殺死大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。15可編輯課件PPT4．染色：①初染:將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，1min。②媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。③脫色：水洗后用95％乙醇脫色，并搖動(dòng)玻片，直至流下的液體無色為止，約需0.5min。④復(fù)染：水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色，1min。⑤水洗，用濾紙吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行鏡檢。5．鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。。

16可編輯課件PPT注意事項(xiàng)：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時(shí)間要很好掌握。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時(shí)取菌要少，涂片薄而均勻?yàn)楹?。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會(huì)影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內(nèi)。17可編輯課件PPT革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理鹽水接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色0.5min固定初染1min復(fù)染1min干燥

鏡檢

復(fù)紅18可編輯課件PPT銅綠假單胞菌鏡下形態(tài)圖示：19可編輯課件PPT氧化酶試驗(yàn)原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統(tǒng)扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細(xì)胞色素（reduced

cytochrome）氧化，產(chǎn)生水或過氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實(shí)驗(yàn)有助于區(qū)分奈瑟氏菌屬（Neisseria）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽性(oxidase

positive)，與腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）此科之細(xì)菌為氧化酵素陰性（oxidase

negative）。

方法：白色濾紙片取菌+1滴1%二甲基對苯二胺↓15~30s變紅色（+）不變色（-）20可編輯課件PPT實(shí)驗(yàn)三

結(jié)果觀察及報(bào)告

21可編輯課件PPT綠膿菌素實(shí)驗(yàn)：2~3個(gè)可疑菌落→綠膿菌素培養(yǎng)基→37℃24h→3~5mL氯仿→振蕩提取液呈藍(lán)色→取液體于一新試管+1mL1mol/L鹽酸上層鹽酸內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性，不變色則為陰性。硝酸鹽還原產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)：可疑菌落→硝酸鹽蛋白胨水→37℃24h→小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生為陽性，否則陰性。22可編輯課件PPT明膠液化實(shí)驗(yàn)：可疑菌落→穿刺接種于明膠培養(yǎng)基→37℃24h→取出放冰箱10~30min呈溶解狀為陽性，不溶解則為陰性。42℃生長實(shí)驗(yàn)：可疑菌落→普通瓊脂斜面→42℃24h→銅綠假單胞菌生長，而近似的熒光假單胞菌不能生長。23可編輯課件PPT結(jié)果判斷

氧化酶（+）綠膿菌素（+）可報(bào)告檢出

典型或可疑菌落氧化酶（+）綠膿菌素（-）

明膠液化（+）可報(bào)告檢出硝酸產(chǎn)氣（+）42℃生長（+）24可編輯課件PPT革蘭氏染色（Gramstaining）:革蘭氏染色法是由丹麥醫(yī)生Gram于1884年創(chuàng)立，其簡要操作分初染→媒染→脫色→復(fù)染。如果染色得當(dāng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)G+菌體呈藍(lán)紫色，G-菌體呈淺紅色。通過革蘭氏染色法可把所有細(xì)菌分兩在類。因此它是分類鑒定菌種的重要指標(biāo)。其染色機(jī)制：通過初染和媒染操作后，在細(xì)菌細(xì)胞的膜或原生質(zhì)體上染上了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的大分子復(fù)合物。

革蘭氏染色陽性（GramPositive）:革蘭氏陽性菌由于細(xì)胞壁厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊密，故在用乙醇洗脫時(shí)，肽聚糖網(wǎng)孔會(huì)因脫水而明顯收縮，再加上它基本不含類脂，故用乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，因此結(jié)晶紫與碘復(fù)合物仍牢牢阻留下其細(xì)胞壁內(nèi)