NY-T 4362-2023 飼料添加劑 角蛋白酶活力的測定 分光光度法

ny/tny/t1362—2023ICS65.120ICS65.120CCSB46NY中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T4362-2023飼料添加劑角蛋白酶活力的測定

分光光度法Feedadditives Determinationofkeratinaseactivity—

Spectrophotometricmethod2023-08-01實施2023-04-112023-08-01實施中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布刖 本文件按照GB/T1.1 2020?標準化T作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起單規(guī)則》的規(guī)定起草，it注意本文件的某些內(nèi)容吋能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承拉識別專利的責任。本文件由農(nóng)收農(nóng)村部備牧&醫(yī)局提;IL本文件由全國飼料工業(yè)標準化技術委員會(SAC/TC76)!IJU。本文件起草單位：中W農(nóng)業(yè)科孕院飼料研究所、山東降科特酣制劑冇限公司、福建倣農(nóng)生物科技集W股份有限公司、廣州立達爾生物科技股份有限公司.本文件主要起孕人，丁宏標、錢娟娟、侯玉煌，周盛M、陶正國，李4龍、劉勝利。ny/tny/t1362—2023II飼料添加劑角蛋白酶活力的測定

分光光度法1范圍本文件描述r飼料添加劑角蛋白酶活力的分光光度測定方法。本文件適用于飼料添加劑角蛋白酶產(chǎn)品中酶活力的測定。本文件的方法定最限為100U/g(U/mIJ。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注□期的引用文件.僅該日期對應的版本適用于本文件》不注日期的引用文件.K最新版本(包拈所有的修改單)適用于本文件》(；B5009.5—2006食品安全國家標準含品屮蛋閂質(zhì)的測定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制蓓3術語和定義下列術語和定義適用于本文件，3.1角蛋白酶keratinase產(chǎn)自地衣芽孢桿菌.可以降解羽毛等動拉物角蛋白生成氨堆酸或肽類的蛋fl酶。3.2角蛋白酶活力單位keratinaseactivityunit在40X：、PH8.0的條件下.水解酪蛋閂，每分鐘產(chǎn)生IPg的酪衩酸的解S為一個酶活力單位，注：單傳為LL4原理在一定的溫度和pH條件下.角蛋白酶水解酪蛋白底物產(chǎn)生含有酚基和吲哚基的氨基酸.用氯乙酸沉淀后，在堿性條件下，將描林試劑還原，/|:成磷鎢鉬般.在680nm有辰大吸收.K顏色的深淺與酚基氨基肢含呈成正比。采用分光光度法測定反應液吸光位.計算角蛋白梅活力。5試劑或材料除非另有說明.僅使用分析純試劑。1水：GB/T6682,三級。5.2碳酪鈉溶液(0.4mol/L)：稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL，混勻。3三氯乙酸溶液(0.4mol/L):稱取-氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL,混勻.4鹽酸溶液(1mol/L)：取濃鹽酸85mL.加水稀釋并定容至1000mL,混勻。5.5鹽般溶液(0.1mol/L)：flit10mL1mol/L鹽般溶液(5.4).定容至100mL.混勻。56氫氧化鈉溶液(0.5mol/L)：取氫氣化鈉20.0g.用水溶解.冷卻至室溫后定容至1000mL.混勻。5.7福林(Folin)試劑：于2000ml磨口回流裝S中加人鎢般鈉(NaW(>4?2H0)100.0g、鉬般鈉

(Na2MoO:?2H,())25.Og.水700mL,85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h,取下回流#ny/t4362—2023附泉A(規(guī)范性)角蛋白酶鑒別試驗A.1原理角蛋門解作用于不溶于水的羽毛粉生產(chǎn)可溶于水的氨堪酸或肽類物質(zhì)，經(jīng)與同規(guī)格的屮性蛋門酶、喊性蛋白梅進行羽毛粉降解后的比對，通過凱氏記氮法對溶液屮的筑含量進行比較，可定性判定是否為角蛋白閱。A.2試劑或材料除非另有說明.僅使用分析純試劑。A.2.1水:GB/T6682.三級,A.2.2硼酸鈉溶液：稱取3.80g硼酸鈉(硼砂〉，加水溶解并定容至1000mL,混勻。A.2.3硼酪溶液：稱取12.37K硼酸.加水溶解并定容至1000mL,混勻.A.2.4硼酸緩沖溶液(pH8.0)：取50mLffl酸鈉溶液(A.2.2).用硼酸溶液(A.2.3)將pH調(diào)至8.0±0.備ffl。A.2.5羽毛粉，收集家禽羽毛.蒸餾水消洗干凈，用70%的乙醇浸泡1h后，105X：干燥4h烘至恒重，用粉碎機粉碎1min.待用。A.2.6角蛋內(nèi)酶稀釋液：稱取角蛋內(nèi)酶0.1g?1g.精確至0.0001g,加人ffl胺緩沖溶液(A.2.4)稀釋至10000U/mU如角蛋白酶為液體試樣，吸取0.1mL-1.0mh稀杼至10000U/mL.待用。A.2.7堿性蛋白酶稀釋液：稱取堿性蛋白酶0.1g~lK,牾確至0.0001fj,加人硼酸緩沖浴液(A.2.4)稀擇至10000U/mL。如喊性蛋白梅為液體試樣.吸取0.1mL-1.0mL稀擇至10000U/mL.待用。A.2.8中性蛋白酶稀釋液：稱取中性蛋白酶0.1g~lg.栢確至0.0001g.加人硼酸緩沖溶液(A.2.4)稀釋至10000U/mL.如屮性蛋白梅力液體試樣，吸取0.1mL~1.0mL稀釋至10000U/mL.待用。A.3儀器設備A.3.1恒溫水?。嚎荻葹橥?.2V'。A.3.2恒溫T燥箱：精度為±1V，A.3.3萬能粉碎機：25000r/min.A.3.4A塞比色管：25mL.A.4試驗步驟A.4.1羽毛粉降解分別準確稱取0.10g羽毛粉于3個25mL的:H塞比色竹中.分別向3個比色竹中加人10000U/mL的角蛋1'1酶稀釋液＜A.2.6)20mL、緘性蛋A酶稀釋液(A.2.7)20mL、中性蛋fI釀稀釋液(A.2.8)20mL,搖勻后S于40t水浴中反應24h。24h后取出3個具塞比色管，用定性濾紙過濾，分別取濾液2.0mL分別進行蛋白質(zhì)含M測定。測定結(jié)果分別為注：當角蛋A曲樣品活力＜50000u./g時，可以適內(nèi)增人稀擇倍數(shù)，角蛋A酶，喊性蛋A?、中性蛋白酶可