體內(nèi)藥物分析課件

離子對色譜法

分正相和反相離子對色譜法。反相離子對色譜法將離子對試劑加入到含水流動相中，被分析組分的離子在流動相中與離子對試劑的反離子（或?qū)﹄x子，counterion）生成不荷電的中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相間的疏水性締合作用，使分配係數(shù)增加，改善分離效果。RP-IPC用於分離可離子化（有機酸、堿、鹽）或離子型化合物。1．離子對模型以有機堿（B）為例。調(diào)節(jié)流動相pH，使堿轉(zhuǎn)變?yōu)檎x子BH+形式，則BH+與流動相中離子對試劑（烷基磺酸鹽）的反離子RSO3-生成不荷電的中性離子對，此中性離子對在固定相和流動相間達到分配平衡。

B+H+?BH+RSO3Na?RSO3-+Na+BH++RSO3-?(BH+?RSO3-)m?(BH+?RSO3-)s以通式表示：(B+)m+(A-)m?(B+?A-)m?(B+?A-)sB+:

溶質(zhì)離子，A-:離子對試劑反離子，m:表示流動相，s:表示固定相溶質(zhì)離子B在固定相和流動相間的分配係數(shù)：

KB==?[A-]m=EBA[A-]mEBA為萃取常數(shù)。溶質(zhì)的分配係數(shù)決定於離子對試劑的濃度和萃取常數(shù)。萃取常數(shù)又與固定相、離子對試劑和溶質(zhì)的性質(zhì)、溫度有關(guān)。2.影響容量因數(shù)的因素1)離子對試劑的種類：離子對試劑的碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；分析酸類或帶負(fù)電荷的物質(zhì)時，一般用季銨鹽作離子對試劑，如四丁基銨磷酸鹽，溴化十六烷基三甲基銨等；分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)時，一般用烷基磺酸鹽作離子對試劑，如正戊烷基、正己烷基、正庚烷基磺酸鈉等。2)離子對試劑的濃度：低濃度範(fàn)圍內(nèi)，溶質(zhì)的k隨離子對試劑的濃度升高而增大，最後趨於恒定。對長鏈離子對試劑（如正癸烷磺酸鹽），當(dāng)離子對試劑的濃度超過一定值時，k反而減少，溶質(zhì)的k出現(xiàn)極大值現(xiàn)象。這是離子對試劑形成膠束的結(jié)果。3)流動相pH:對弱酸、弱鹼的k影響較大。六．手性色譜法chiralchromatography藥物對映體具有不同的藥動學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)。

DL-合黴素的療效為D-氯黴素的一半；普萘洛爾（propranolol）L-異構(gòu)體的藥物活性比D-異構(gòu)體大100倍；1．手性藥物分離(拆分)分析的作用對某些手性藥物進行對映體的純度檢查；探索血藥濃度與臨床療效的關(guān)係----生物體液中藥物對映體的分離分析；在研製手性藥物過程中，分別評價單個對映體的效價、毒性、不良反應(yīng)及藥物動力學(xué)性質(zhì)。2．手性HPLC拆分法分類包括柱前手性衍生試劑法（chiralderivatizationreagent,CDR）,手性流動相法（chiralmobilephase,CMP）和手性固定相法（chiralstationaryphase,CSP）.1）CDR法對映異構(gòu)體與光學(xué)純手性試劑反應(yīng)，生成相應(yīng)的非對映異構(gòu)體。採用普通固定相分離。

(R)—SA→(R)—SE—(R)—SA（R）—SE+(S)—SA→(R)—SE—(S)—SA2）CMP法常用手性添加劑：（1）配基交換型手性添加劑：常用手性配基為光學(xué)活性氨基酸及其衍生物的二價金屬離子螯合物。它們和手性藥物消旋體形成非對映異構(gòu)配位絡(luò)合物對。例如，分離DL-色氨酸手性異構(gòu)體，可在流動相中加入L-苯丙氨酸-Cu2+作為手性添加劑。（2）環(huán)糊精類添加劑（cyclodextrins,CD）結(jié)構(gòu)特點：環(huán)狀低聚糖，外部邊緣有許多羥基，內(nèi)部為相對疏水的空腔，每個葡萄糖單元有5個手性碳原子。常用：β-CD,γ-CD以及它們的各種改性CD。（3）手性離子對絡(luò)合劑帶電手性藥物與手性離子對絡(luò)合成電中性非對映體絡(luò)合物對。常用手性離子對絡(luò)合劑：（+）-10-樟腦磺酸，奎寧，奎尼丁等。3）CSP法

常用手性固定相為：（1）Pirkle型手性固定相Pirkle實驗室研究的手性固定相。主要有：電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相固定相分子與對映體分子間發(fā)生π-π電荷轉(zhuǎn)移作用。包括：

π電子給予體手性固定相；

π電子接受體手性固定相。氨基酸類手性固定相（2）蛋白質(zhì)類手性固定相廣泛應(yīng)用的是牛血清蛋白和人血α1-酸性糖蛋白鍵合矽膠手性固定相（通過氨基酸鍵合）。（3）環(huán)糊精類手性固定相六．親合色譜法affinitychromatography,AC

是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從複雜生物試樣中分離分析特殊物質(zhì)的一種色譜方法。

AC是選擇性最高的一種色譜分離模式。具有專一親和特性的生物分子對：抗體與抗原；酶與底物；激素或藥物與受體；RNA與和它互補的DNA。將上述分子對的其中之一固定在載體上，形成固定相，可用於分離分析與之有專一親合性的物質(zhì)。常用載體為多孔矽膠。七．離子色譜法ionchromatography將離子交換法與電導(dǎo)檢測器相結(jié)合分離分析各種離子的方法，分雙柱型（抑制型）和單柱型（非抑制型）離子色譜法。八．HPLC中的速率理論H=A+B/u+Cu(一)渦流擴散

A=2λdpλ:填充不規(guī)則因數(shù)；

dp：固定相顆粒粒徑固定相顆粒越小，填充越均勻，A越小。（二）縱向擴散縱向擴散係數(shù)β=2γDmDm:組分在流動相中的擴散係數(shù)，與流動相的粘度成反比，與溫度成正比。HPLC中，流動相是液體，粘度較大；在室溫下工作。Dm較小HPLC的縱向擴散可以忽略不計。（三）傳質(zhì)阻抗1.固定相傳質(zhì)阻抗Cs：鍵合固定相多為單分子層，其厚度可忽略，因此Cs可忽略。

2.流動相傳質(zhì)阻抗Cm位於流動相流路中心的組分分子還未來得及擴散進入流動相和固定相介面，就被流動相帶走，此部分分子總比靠近固定相顆粒表面的組分分子移動得快些，結(jié)果使峰展寬。

Cm=3.靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗Csm固定相具有多孔性，部分流動相會滯留在微孔內(nèi)，這部分流動相中的組分的傳質(zhì)過程存在靜態(tài)傳質(zhì)阻抗。

Csm

根據(jù)速率理論，提高HPLC柱效，應(yīng)採用下列條件：小粒徑，均勻的球形化學(xué)鍵合相；低粘度流動相，流速不宜快；常用甲醇（η=0.54mPa?s）,乙腈（η=0.34mPa?s）作流動相成分不用乙醇（η=1.08mPa?s）柱溫適當(dāng)。小粒徑是保證HPLC高柱效的主要措施。九．HPLC分析方法（一）定性分析方法1．色譜鑒定法：只能對範(fàn)圍已知的化合物定性。定性原理：同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時間（或保留體積或相對保留值）相同。2．化學(xué)鑒定法收集色譜餾分，在利用化學(xué)反應(yīng)進行鑒定。3.兩譜聯(lián)用鑒定法：離線：製備HPLC獲得純組分，用UV,IR,MSNMR鑒定；線上：聯(lián)用儀（二）定量分析法1．色譜峰面積對正常色譜峰：A=1.065×h×W1/2

2.色譜定量分析依據(jù)：被測物質(zhì)的量與其色譜峰峰面積成正比例關(guān)係。3.定量校正因數(shù)同一種檢測器對相同量的不同類型物質(zhì)有不同回應(yīng)值，同一種物質(zhì)在不同檢測器上有不同回應(yīng)靈敏度，因此不能用峰面積直接計算物質(zhì)的含量，而需引入定量校正因數(shù)。1)絕對校正因數(shù)：

fi’=mi/Ai單位面積所代表的物質(zhì)的品質(zhì)。2)相對定量校正因數(shù)：物質(zhì)i和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對校正因數(shù)之比

fi=fi’/fs’=4.

定量方法常用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法1）外標(biāo)法（校正曲線法）：在一定色譜條件下，用一系列不同濃度的對照品溶液進樣分析，得一系列色譜圖，以各色譜峰面積或峰高對對照品溶液的量或濃度作圖，得校正曲線，求得線性回歸方程

A=a+bC（或m）。對樣品溶液進樣分析，得峰面積，根據(jù)校正曲線，求得樣品的量或濃度。外標(biāo)一點法（對比法）：若校正曲線線性好，截距近似為零，可用。

mi=AR及mR分別為對照品溶液在進樣體積中所含組分的品質(zhì)和相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法特點：不需用校正因數(shù)；不需內(nèi)標(biāo)；分析結(jié)果的準(zhǔn)確度主要取決於進樣量的重複性和色譜條件的穩(wěn)定性。2）內(nèi)標(biāo)法以一定量純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物，加到準(zhǔn)確稱取的試樣中，進樣分析，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的品質(zhì)及峰面積，計算樣品組分的含量。

mi=fiAi,ms=fsAsmi=內(nèi)標(biāo)法特點：可抵消樣品預(yù)處理、儀器不穩(wěn)定、色譜條件不穩(wěn)定、進樣量（指進樣體積）不準(zhǔn)確等原因帶來的誤差。通常內(nèi)標(biāo)在試樣預(yù)處理前加入。內(nèi)標(biāo)的選擇：內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是試樣中不存在的純物質(zhì)；內(nèi)標(biāo)物色譜峰位於被測組分色譜峰附近或幾個被測組分色譜峰中間，並與各組分峰完全分離。3）內(nèi)標(biāo)校正曲線法類似於外標(biāo)法。在各濃度的對照品溶液中加入相同量的內(nèi)標(biāo)物。線性回歸方程為：AR/As=a+bC（或m）若截距近似為零，可用內(nèi)標(biāo)一點法定量：

Ci=×該法特點：不需用校正因數(shù)；可抵消樣品預(yù)處理、儀器不穩(wěn)定、色譜條件不穩(wěn)定、進樣量（指進樣體積）不準(zhǔn)確等原因帶來的誤差。4）內(nèi)標(biāo)校正因數(shù)法先在對照品溶液中，加入一定量內(nèi)標(biāo)物，進樣分析，求得樣品組分的相對校正因數(shù)：fi=含一定量內(nèi)標(biāo)物的試樣溶液進樣分析，求得：

mi==fs=1該法實際為內(nèi)標(biāo)一點法5）內(nèi)加法將待測組分的對照品加到待測試樣溶液中，測定增加對照品後的溶液中組分的峰面積比原試樣溶液中組分的峰面積的增加量，計算組分的含量。

mi=特點：不需內(nèi)標(biāo)物；可克服進樣量的不準(zhǔn)確帶來的定量誤差;只求多組分混合物中某一組分的含量，而又沒有合適的內(nèi)標(biāo)物時，可採用此法。６）歸一化法mi%=

特點：定量結(jié)果與進樣量無關(guān)；操作條件變化時對測定結(jié)果影響較??；在一個分析週期內(nèi)，所有組分都必須流出色譜柱，且檢測器對它們都產(chǎn)生信號；不能用於微量雜質(zhì)的含量測定。十．HPLC分離方法的選擇(一）分子量小於1000的組分1.組分溶於有機溶劑，可用：1）LSCSP:矽膠；MP:有機溶劑。2）反相色譜

SP:-C18,C8等；

MP：甲醇，乙腈，THF的混合液3）正相色譜

SP:-CN,-NH2鍵合相，MP：有機溶劑2.組分溶於水，可用：1）非離子型化合物用反相色譜SP:-C18,C8等MP：水或緩衝溶液，甲醇，乙腈，THF的混合液2)可離子化化合物用反相離子對色譜SP：-C18,C8等MP：水或緩衝溶液（含離子對試劑），甲醇，乙腈，THF的混合液3）離子型化合物可用離子交換色譜或採用反相離子對色譜SP:-SO3H,-NR3Cl型離子交換劑MP：緩衝液緒論一．藥物分析的性質(zhì)

藥物分析是以藥品質(zhì)量控制為研究目的一門學(xué)科。主要運用化學(xué)、物理學(xué)或生物學(xué)等學(xué)科的方法和技術(shù)研究各種藥物及其制劑（合成藥物、天然藥物、生物藥物及其制劑，中藥制劑）的質(zhì)量控制方法。1．綜合性

常規(guī)化學(xué)分析；儀器分析；計算藥物分析；

X-射線衍射，熱分析；

DNA、蛋白質(zhì)、基因分析，免疫分析，細(xì)胞分析，體內(nèi)藥物分析。2．指導(dǎo)性

眼睛學(xué)科，先峰學(xué)科我國中藥製劑目前存在的問題：缺乏明確的品質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn)，不能很好地打入國際市場。二．藥物分析的主要任務(wù)1．常規(guī)藥品檢驗藥物分析的主體、核心。分析對象主要是各藥廠生產(chǎn)的常規(guī)製劑（已用於臨床）及原料藥、醫(yī)院製劑。2．為新藥研究服務(wù)如新藥品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定藥物動力學(xué)研究新原料藥的合成，天然產(chǎn)物的研究：結(jié)構(gòu)鑒定，藥物與雜質(zhì)的分離3．研究藥物分析新方法、新技術(shù)分析手段的發(fā)展：化學(xué)分析

紙色譜、TLC

GC（填充柱、毛細(xì)管柱）

HPLC

CE、CEC

各種聯(lián)用技術(shù)分析狀態(tài)的發(fā)展：靜態(tài)分析

即時動態(tài)分析分析對象的發(fā)展：血漿

多細(xì)胞

單細(xì)胞、單分子手性藥物分析的發(fā)展：外消旋體

左、右旋體分別分析研究目的：以新方法、新技術(shù)本身為主要目的

---基礎(chǔ)理論研究以分析對象為主要目的---應(yīng)用研究4．與藥物分析有關(guān)的其他工作三．藥品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)是國家對藥品品質(zhì)規(guī)格及檢驗方法所作的技術(shù)規(guī)定，是藥品生產(chǎn)、供應(yīng)、使用、檢驗和管理部門共同遵循的法定依據(jù)。包括：國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：藥典、中國生物製品規(guī)程等部頒標(biāo)準(zhǔn)：如中國醫(yī)院製劑規(guī)範(fàn)地方標(biāo)準(zhǔn)四．藥典pharmacopoeia是記載藥品標(biāo)準(zhǔn)的法典。凡是藥典收錄的藥品，其品質(zhì)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的均不得出廠，不得銷售，不得使用。（一）中國藥典1．沿革：已出版：1953，1963，1977，1985，1990，1995，2000年版2．基本結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容ChP由凡例、正文、附錄和索引四部分組成。（1）凡例

1）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：對有關(guān)規(guī)定、要求和含義等所作的說明。如避光是指用不透光的容器包裝；陰涼處系指不超過20oC等

2）檢驗方法和限度

ChP收載的原料藥及製劑均應(yīng)按規(guī)定方法進行檢驗；或?qū)⑵渌椒ㄅc規(guī)定方法對照。限度不是真實含量。若未規(guī)定上限，系指不超過101.0%。

3）標(biāo)準(zhǔn)品和對照品

指用於鑒別、檢查和含量測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。不包括色譜用的內(nèi)標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)品：是指用於生物檢定、抗生素或生化藥品中含量或效價測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按效價單位或μg計。對照品：除另有規(guī)定外，均按乾燥品或無水物計算後使用。

4）計量：法定計量單位

5）精確度精密稱定：準(zhǔn)確至所取重量的千分之一。稱定：準(zhǔn)確至所取重量的百分之一。取用量約若干：指該量不得超過規(guī)定量的±10%。精密量?。褐噶咳◇w積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合該體積移液管的精密度要求。稱取、量?。浩渚_度可根據(jù)數(shù)值的有效數(shù)位來確定。如稱取0.1g，指稱取重量可在0.06-0.14g範(fàn)圍內(nèi)；2g-----1.5-2.5g；2.0g----1.95-2.05g;2.00g---1.995g-2.005g恒重：小於0.3mg按乾燥品（或無水物，或無溶劑）計算：除另有規(guī)定外，應(yīng)取未經(jīng)乾燥（或未去水或未去溶劑）的供試品進行試驗，測得乾燥失重後，再在計算時從取用量中扣除．空白試驗：不加供試品或以等量溶劑替代供試液，同法操作所得結(jié)果。試驗溫度：如不說明，系指室溫，通常以25±2℃為準(zhǔn)。

6）包裝、標(biāo)籤（2）正文

收載不同藥品、製劑的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

藥品名稱包括：中文名（中國藥品通用名稱），中文拼音名稱和英文名稱。*中藥材不使用英文名稱，而採用拉丁名稱。（3）附錄主要內(nèi)容：製劑通則，生物製品通則，通用檢測方法，生物檢定法，試藥與試液，溶液配製，原子量表等（4）索引：中（按中文拼音順序排列）、英文（二）常用外國藥典１．美國藥典USP與美國國家處方集NF(Nationalformulation)合併出版；從2002年起，USP-NF將原來的每5年一版改為每年出一版，最新版為USP26-NF21。同時還發(fā)行了亞洲版。２．英國藥典BP也有《英國國家處方集》配套出版。３．日本藥局方JP４．歐洲藥典Ph.Eur.有英文和法文兩種文本。五．藥品檢驗工作的基本程式1．取樣從大量樣品中取出少量樣品，應(yīng)考慮取樣的科學(xué)性、真實性和代表性。取樣基本原則：均勻、合理。2．藥物的鑒別：判斷藥品的真?zhèn)胃鶕?jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行某些化學(xué)反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象判斷；或測定理化常數(shù)或光譜特徵，來判斷。其他包括藥品的外觀、顏色、氣味等的鑒別。應(yīng)結(jié)合多個鑒別試驗結(jié)果進行判斷，而不能以單個鑒別試驗判斷，否則會誤判。3．藥物的檢查

主要指純度檢查：是限度檢查4．藥物的含量測定測定主要有效成分的含量。**第3和第4項可用來判斷藥品品質(zhì)的優(yōu)劣。5．檢驗報告的書寫完整、清楚地記錄原始資料，並寫出檢驗報告（給出結(jié)論）。六．全面控制藥品品質(zhì)的科學(xué)管理良好藥品實驗研究規(guī)範(fàn)（goodlaboratorypractice,GLP）即藥品非臨床研究品質(zhì)管理規(guī)範(fàn)?？茖W(xué)、可靠的研究方法才能得出有效、可靠的實驗數(shù)據(jù)，故需對新藥研究條件作嚴(yán)格規(guī)定。良好藥品臨床試驗規(guī)範(fàn)（goodClinicalpractice,GCP）

GCP可保護受試者的安全和權(quán)利，有助於保證提供有價值的臨床研究資料。良好藥品生產(chǎn)規(guī)範(fàn)（goodmanufacturepractice,GMP）即藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範(fàn)良好藥品供應(yīng)規(guī)範(fàn)（goodsupplypractice,GSP）保證藥品在運輸、貯存和銷售過程中的品質(zhì)SomeJournalsor→電子資源→ElsvierSDOSJournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysisJournalofChromatographyAJournalofChromatographyBAnalyticalChimicaActaTalantaTrendsinAnalyticalChemistryJournalofElectroanalyticalChemistryAnalyticalChemistryJournalofMedicinalChemistryMolecularPharmaceuticsBiomacromoleculesBiochemistryAnalyst

ElectrophoresisJournalofPharmaceuticalScienceJournalofSeparationScienceChiralityJournalofMicrocolumnSeparationJournalofMassSpectrosmetryLuminescenceBiomedicalChromatographyBiopharmaceuticsanddrugDispositionDrugdevelopmentResearchElectroanalysisJournalofBioluminescenceandChemiluminescenceSingleMolecules藥學(xué)學(xué)報中國藥學(xué)雜誌藥物分析雜誌藥學(xué)通報國外醫(yī)學(xué)-藥學(xué)分冊藥學(xué)進展化學(xué)學(xué)報分析化學(xué)高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報色譜化學(xué)進展各主要大學(xué)學(xué)報第一章藥物的鑒別試驗

（identificationtest）第一節(jié)概述

ChP和其他各國藥典所收載的藥物項下的鑒別試驗方法，僅適用於貯臧在有標(biāo)籤容器中的藥物，用以證實是否為所標(biāo)示的藥物。這些方法不能用於鑒別未知物。一．鑒別專案（一）性狀：包括外觀、色澤、臭、味、溶解度及一些物理常數(shù)。（二）一般鑒別試驗（generalidentificationtest,GIT）GIT僅適用於確認(rèn)單一的化學(xué)藥物，對多種化學(xué)藥物的混合物或有干擾物質(zhì)存在時，除另有規(guī)定外，不適用。GIT只能證實藥物的類別，將藥物與其它類別的藥物區(qū)分開，不能證實是哪一種藥物。（三）專屬鑒別試驗（specificidentification,SIT)在GIT的基礎(chǔ)上進行，可證實藥物屬於某類藥物的哪一種。SIT根據(jù)每種藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異及其所引起的物理化學(xué)特性的差異，採用靈敏、選擇性強的定性反應(yīng)進行。二．鑒別試驗條件1．溶液的濃度：主要指被鑒別藥物的濃度，但其他試劑的濃度也應(yīng)注意控制，特別是以化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)現(xiàn)象為依據(jù)進行鑒別的情況。藥物+試劑

產(chǎn)物（顏色、沉澱等）2．溶液的溫度影響化學(xué)反應(yīng)的快慢。一般溫度每升高10℃，可使反應(yīng)速度增加2-4倍。3．溶液的酸鹼度溶液的酸鹼度應(yīng)能使各反應(yīng)物有足夠的濃度處於反應(yīng)活化狀態(tài)，並使反應(yīng)生成物處於穩(wěn)定、易於觀測的狀態(tài)。4．干擾成分採用專屬性更高的鑒別反應(yīng)或?qū)⒏蓴_成分分離除去，以消除干擾。５．試驗時間對有機化合物的化學(xué)反應(yīng)影響較大。因為有機反應(yīng)能否進行，取決於舊共價鍵斷裂和新共價鍵形成的難易，而這些共價鍵的更替需要一定時間。三．鑒別試驗的靈敏度sensitivity

１．反應(yīng)靈敏度最低檢出量（minimumdetectablequantity,mmin）：應(yīng)用某一反應(yīng)，在一定反應(yīng)條件下，能觀測出反應(yīng)結(jié)果所需的供試品的最小量。最低檢出濃度（minimumdetectableconcentration,Cmin）：應(yīng)用某一反應(yīng)，在一定反應(yīng)條件下，能觀測出反應(yīng)結(jié)果所需的供試品的最小濃度。**檢測限（limitofdetection,LOD）zeptomole:10-21zmol；attomole:10-18amolfemtomole:10-15fmol；picomole:10-12pmolnanomole:10-9nmol2.空白試驗blanktest消除試劑和器皿可能帶來的影響。在與供試品鑒別試驗完全相同的條件下，除不加供試品外（或以等量溶劑替代供試液），其他試劑同樣加入進行的試驗。3．提高反應(yīng)靈敏度的方法1）消除干擾：如螢光法需濾出天然光和激發(fā)光的干擾。2）改進觀測方法：如將目視觀測溶液的顏色改為可見分光光度法。3）加入與水互不相溶的有機溶劑：濃集有色生成物（脂溶性）於有機溶劑中→顏色加深，易觀察。第二節(jié)藥物的一般鑒別試驗一．鑒別方法（一）化學(xué)鑒別法

1．幹法：無溶劑參與反應(yīng)焰色試驗：鑒別鹽的類型氣體產(chǎn)生法：在適當(dāng)溫度條件下，加熱使供試品分解，生成有特殊氣味的氣體。２．濕法：鑒別反應(yīng)在適當(dāng)溶劑中進行，發(fā)生易於觀測的化學(xué)變化，如顏色、沉澱、氣體、螢光等。１）呈色反應(yīng)鑒別法：常用反應(yīng)有：三氯化鐵呈色反應(yīng)：適用於含Ar-OH或可產(chǎn)生Ar-OH的藥物。異羥肟酸鐵反應(yīng)：多適用於芳酸及其酯類、醯胺類。印三酮呈色反應(yīng)：多適用於含脂肪胺基的藥物。重氮化-偶合顯色反應(yīng)：適用於含Ar-NH2

或能產(chǎn)生Ar-NH2

的藥物。氧化還原顯色反應(yīng)２）沉澱生成反應(yīng)鑒別法與重金屬離子的沉澱反應(yīng)：重金屬指比重大於5的金屬，如Cu，Ni，Pb，Zn，Sn，W等。與硫氰化鉻銨（雷氏鹽）的沉澱反應(yīng)：主要適用於生物鹼及其鹽、具有芳香環(huán)的有機堿及其鹽。

3）螢光反應(yīng)鑒別法螢光：是分子吸收了較短波長的光（激發(fā)光，通常為可見和UV光），在很短時間內(nèi)發(fā)射出的較長波長的光。除去激發(fā)光源後，螢光立即熄滅。

常用螢光發(fā)射形式：藥物本身在UV或可見光下發(fā)射螢光----自發(fā)螢光。藥物溶液+硫酸呈酸性後，發(fā)射；藥物+Br2反應(yīng)後，發(fā)射；藥物+間苯二酚反應(yīng)後，發(fā)射----衍生後發(fā)螢光。４）氣體生成反應(yīng)鑒別法

氨氣（胺氣）生成法：適用於胺（銨）類、醯胺類及醯脲類藥物。藥物經(jīng)強鹼處理後，加熱，可產(chǎn)生NH3or胺氣。

H2S氣體生成法：適用於含硫藥物。經(jīng)強酸處理，加熱，產(chǎn)生H2S。碘蒸氣生成法：適用於含碘有機藥物。經(jīng)直火加熱，生成紫色碘蒸氣。醋酸乙酯生成法：適用於含醋酸酯的藥物和乙醯胺類藥物。二．電磁輻射與電磁波譜1.光：是一種電磁輻射（即電磁波）。具有波粒二相性。光的波動性：用波長、波數(shù)和頻率表徵

ν=c/λ光的微粒性：用每個光子具有的能量表徵

E=hνh=6.63×10-34J.S2.電磁波譜γ射線→X射線→UV→可見→紅外→微波→無線電波波長逐漸變長三．電磁輻射與物質(zhì)的相互作用常見電磁輻射與物質(zhì)相互作用的術(shù)語：１．吸收：是原子、分子或離子吸收光子的能量（等於基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差），從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)的過程。２．發(fā)射：是物質(zhì)從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)，並以光的形式釋放能量的過程。３．散射：是光通過介質(zhì)時，與介質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞所致，碰撞時沒有能量交換，光頻率不變，但光子的運動方向發(fā)生改變。三．電磁輻射與物質(zhì)的相互作用４．拉曼散射：是光通過介質(zhì)時，與介質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞所致，碰撞時不僅光子的運動方向發(fā)生改變，而且還有能量交換，光頻率發(fā)生變化。５．折射和反射６．干涉和衍射四．光學(xué)分析法的分類

表1:原理分析方法輻射的發(fā)射1)發(fā)射光譜法2）螢光光譜法3）火焰光度法輻射的吸收1）比色法2）分光光度法（可見，紫外，紅外等）

3）原子吸收法4）核磁共振法輻射的散射1）拉曼散射2）散射濁度法輻射的折射折射法輻射的衍射1）X-射線衍射法2）電子衍射法輻射的旋轉(zhuǎn)1）偏振法2）旋光法3）圓二色光譜法（一）光譜法與非光譜法１．光譜法：利用物質(zhì)的光譜進行定性定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。有3種基本類型：吸收光譜法、發(fā)射光譜法和散射光譜法光譜（spectrum）是物質(zhì)與輻射能相互作用時，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生能級躍遷所產(chǎn)生的輻射能強度隨波長變化的圖譜。

2．非光譜法：不涉及物質(zhì)內(nèi)部能級的躍遷，即不以光的波長為特徵訊號，僅測量電磁輻射的某些基本性質(zhì)（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所發(fā)生的變化。（二）原子光譜法和分子光譜法原子光譜法：以測量氣態(tài)原子或離子外層或內(nèi)層電子躍遷所產(chǎn)生的光譜。線狀光譜。分子光譜法：是分子中電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級發(fā)生變化產(chǎn)生的光譜。帶狀光譜。IR,UV,分子螢光等。（三）吸收光譜法與發(fā)射光譜法吸收光譜：是物質(zhì)吸收相應(yīng)的輻射能而產(chǎn)生的光譜。利用物質(zhì)的吸收光譜進行定性定量及結(jié)構(gòu)分析的方法為吸收光譜法。如UV-Vis,IR,NMR發(fā)射光譜：是物質(zhì)的原子、離子或分子受到輻射能、熱能、電能或化學(xué)能的激發(fā)躍遷至激發(fā)態(tài)後，又從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時以輻射的方式釋放能量而產(chǎn)生的光譜。如原子發(fā)射光譜法，原子螢光光譜法，分子螢光光譜法，磷光光譜法等．五．光譜分析儀器研究吸收或發(fā)射的電磁輻射強度與波長關(guān)係的儀器稱分光光度計。其組成圖大致如下：輻射源→分光系統(tǒng)→樣品池→檢測器→訊號處理及顯示器1．分光系統(tǒng)將複合光分解成單色或有一定波長範(fàn)圍的譜帶。分為單色器和濾光片。單色器由入射狹縫、出射狹縫、準(zhǔn)直鏡和色散元件組成。其中色散元件是心臟，有棱鏡和光柵。濾光片有：帶通濾光片：只能分出一個波長帶；截止濾光片：只能消除給定波長以上或以下的所有輻射。凹口濾光片：2．檢測器：多採用光電轉(zhuǎn)換器，包括量子化檢測器（如光電倍增管）和熱檢測器（如真空熱電偶）．第二章紫外-可見分光光度法一．基本原理和概念UV-Vis是研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)（UV:200-400nm，Vis:400-800nm）分子吸收光譜的分析方法。（一）UV-Vis的常用概念1．吸收光譜吸收度或透光率與波長的關(guān)係曲線。2．吸收峰及最大吸收波長λmax3.峰穀及最小吸收波長λmin4.肩峰(shoulderpeak):在一個吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個曲折。5．末端吸收（endabsorption）：在圖譜短波端呈現(xiàn)強吸收但不成峰形的部分。（二）定量原理——Lambert-Beer定律A=-lgT=ECL描述物質(zhì)對單色光吸收的強弱與吸光物質(zhì)的濃度與厚度間關(guān)係的定律。吸收係數(shù)可用於定性定量。百分吸收係數(shù)：指在一定波長下，溶液濃度為1%（W/V,g/ml）,溶液厚度為1cm時的吸光度．摩爾吸收係數(shù)ε：指在一定波長下，溶液濃度為1mol/L,溶液厚度為1cm時的吸光度.ε=(M/10)×

M為摩爾品質(zhì)吸光度的加合性：混合組分的吸光度是各組分吸光度的和。（三）定性依據(jù)

吸收光譜：最大吸收波長吸收係數(shù)兩波長處吸收度比值（四）影響測定準(zhǔn)確性的因素1．偏離Beer定律的因素光學(xué)因素：單色光不純，比色皿厚度的均勻度不合要求。

化學(xué)因素：若溶液為膠體溶液或混濁，則入射光通過溶液時部分光會散射或反射而損失；溶液中的溶質(zhì)因濃度改變而發(fā)生解離、締合、與溶劑相互作用等變化，使吸收發(fā)生改變，偏離Beer定律。2．透光率測定誤差來自儀器的噪音

可見，濃度相對誤差取決於透光率及其測量誤差的大小。A在0.2－0.7範(fàn)圍時，濃度測量值的相對誤差較小。二．紫外-可見分光光度計1．光源鎢燈和鹵鎢燈：發(fā)可見光氫燈和氘燈：發(fā)紫外光2．單色器3．吸收池光學(xué)玻璃吸收池：只能用於可見光區(qū)。熔融石英（氧化矽）吸收池：在紫外光區(qū)和可見光區(qū)都可用。4．檢測器常用光電倍增管、光二極體陣列檢測器（photo-diodearraydetector）三．UV-Vis分析方法（一）定性鑒別

UV-Vis一般採用對比法進行定性鑒別。將試樣的吸收光譜特徵與標(biāo)準(zhǔn)化合物的吸收光譜特徵進行對照比較。１．對比吸收光譜特徵數(shù)據(jù)２．對比吸收度或吸收係數(shù)的比值可消除溶液濃度和吸收厚度的影響。３．對比吸收光譜的一致性（二）純度檢查1．雜質(zhì)檢查2．雜質(zhì)的限量檢查：後面講（三）定量測定1．測定方法的建立（１）查文獻，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)確定有無紫外吸收（２）測定條件的選擇：通過測定吸收光譜，確定波長：一般選擇

max，以提高靈敏度並減少誤差；或無干擾且吸收度較大的峰對應(yīng)的波長；不選擇末端吸收波長。溶劑的選擇：（３）估算靈敏度，決定取樣量標(biāo)準(zhǔn)曲線線性範(fàn)圍的吸收度最好在0.2-0.7之間。（4）空白液：一般以空白體液的提取液為空白，消除體液中其他物質(zhì)的干擾。2．單組分的定量方法1）吸收係數(shù)法：單色光很純時採用

C=A/(εl)2）校正曲線法必須使用相同儀器，且固定工作狀態(tài)和測定條件，否則吸光度和濃度之間的關(guān)係就會偏離線性。３）對照法

Cx=(Ax/As)×Cs

Cs:標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。在相同儀器、相同波長下測定。標(biāo)準(zhǔn)物和試樣為相同物質(zhì)。３．同時測定多組分的定量方法

—計算分光光度法樣品中有兩種組分共存時，各組分吸收光譜相互重疊的程度主要三種：各組分的吸收峰處，其他組分沒有吸收：可按單組分的測定方法，分別在各自的吸收峰處測定。各組分的吸收光譜有部分重疊：可先在λ1處按單組分測定法測得混合溶液中a組分的濃度Ca，再在λ2處測定混合溶液的吸收度A2(a+b),則可根據(jù)吸收度的加和性計算組分b的濃度Cb.

A2(a+b)=A2a+A2b=E2a×Ca+E2b×Cb各組分的吸收光譜完全重疊（相互干擾）：最常見的情況。可採用以下方法測定。１）差示分光光度法（differencespectrophotometry）不需事先分離，能消除背景吸收和干擾物對供試液測定的影響。測定方法與原理：取兩份相等的供試液，製成兩種不同的化學(xué)環(huán)境（如在其一中加酸或堿，改變pH；或在其一中加入能與供試品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的試劑），供試品在不同的化學(xué)環(huán)境中以兩種不同的化學(xué)形式存在（如分子型與離子型，氧化型與還原型），且兩種化學(xué)形式的吸收光譜有顯著差異；而背景吸收和干擾物的吸收不受化學(xué)環(huán)境的影響。將兩份供試液稀釋到相同濃度，分別置於樣品池和參比池中，於適當(dāng)波長處測定吸收度的差值(?A)，即可對供試品進行定量。二．電磁輻射與電磁波譜1.光：是一種電磁輻射（即電磁波）。具有波粒二相性。光的波動性：用波長、波數(shù)和頻率表徵

ν=c/λ光的微粒性：用每個光子具有的能量表徵

E=hνh=6.63×10-34J.S2.電磁波譜γ射線→X射線→UV→可見→紅外→微波→無線電波波長逐漸變長三．電磁輻射與物質(zhì)的相互作用常見電磁輻射與物質(zhì)相互作用的術(shù)語：１．吸收：是原子、分子或離子吸收光子的能量（等於基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差），從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)的過程。２．發(fā)射：是物質(zhì)從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)，並以光的形式釋放能量的過程。３．散射：是光通過介質(zhì)時，與介質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞所致，碰撞時沒有能量交換，光頻率不變，但光子的運動方向發(fā)生改變。三．電磁輻射與物質(zhì)的相互作用４．拉曼散射：是光通過介質(zhì)時，與介質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞所致，碰撞時不僅光子的運動方向發(fā)生改變，而且還有能量交換，光頻率發(fā)生變化。５．折射和反射６．干涉和衍射四．光學(xué)分析法的分類

表1:原理分析方法輻射的發(fā)射1)發(fā)射光譜法2）螢光光譜法3）火焰光度法輻射的吸收1）比色法2）分光光度法（可見，紫外，紅外等）

3）原子吸收法4）核磁共振法輻射的散射1）拉曼散射2）散射濁度法輻射的折射折射法輻射的衍射1）X-射線衍射法2）電子衍射法輻射的旋轉(zhuǎn)1）偏振法2）旋光法3）圓二色光譜法（一）光譜法與非光譜法１．光譜法：利用物質(zhì)的光譜進行定性定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。有3種基本類型：吸收光譜法、發(fā)射光譜法和散射光譜法光譜（spectrum）是物質(zhì)與輻射能相互作用時，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生能級躍遷所產(chǎn)生的輻射能強度隨波長變化的圖譜。

2．非光譜法：不涉及物質(zhì)內(nèi)部能級的躍遷，即不以光的波長為特徵訊號，僅測量電磁輻射的某些基本性質(zhì)（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所發(fā)生的變化。（二）原子光譜法和分子光譜法原子光譜法：以測量氣態(tài)原子或離子外層或內(nèi)層電子躍遷所產(chǎn)生的光譜。線狀光譜。分子光譜法：是分子中電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級發(fā)生變化產(chǎn)生的光譜。帶狀光譜。IR,UV,分子螢光等。（三）吸收光譜法與發(fā)射光譜法吸收光譜：是物質(zhì)吸收相應(yīng)的輻射能而產(chǎn)生的光譜。利用物質(zhì)的吸收光譜進行定性定量及結(jié)構(gòu)分析的方法為吸收光譜法。如UV-Vis,IR,NMR發(fā)射光譜：是物質(zhì)的原子、離子或分子受到輻射能、熱能、電能或化學(xué)能的激發(fā)躍遷至激發(fā)態(tài)後，有激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時以輻射的方式釋放能量而產(chǎn)生的光譜。如原子發(fā)射光譜法，原子螢光光譜法，分子螢光光譜法，磷光光譜法等．五．光譜分析儀器研究吸收或發(fā)射的電磁輻射強度與波長關(guān)係的儀器稱分光光度計。其組成圖大致如下：輻射源→分光系統(tǒng)→樣品池→檢測器→訊號處理及顯示器1．分光系統(tǒng)將複合光分解成單色或有一定波長範(fàn)圍的譜帶。分為單色器和濾光片。單色器由入射狹縫、出射狹縫、準(zhǔn)直鏡和色散元件組成。其中色散元件是心臟，有棱鏡和光柵。濾光片有：帶通濾光片：只能分出一個波長帶；截止濾光片：只能消除給定波長以上或以下的所有輻射。凹口濾光片：2．檢測器：多採用光電轉(zhuǎn)換器，包括量子化檢測器（如光電倍增管）和熱檢測器（如真空熱電偶）．第二章紫外-可見分光光度法一．基本原理和概念UV-Vis是研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)（UV:200-400nm，Vis:400-800nm）分子吸收光譜的分析方法。（一）UV-Vis的常用概念1．吸收光譜吸收度或透光率與波長的關(guān)係曲線。2．吸收峰及最大吸收波長λmax3.峰穀及最小吸收波長λmin4.肩峰(shoulderpeak):在一個吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個曲折。5．末端吸收（endabsorption）：在圖譜短波端呈現(xiàn)強吸收但不成峰形的部分。（二）定量原理——Lambert-Beer定律A=-lgT=ECL描述物質(zhì)對單色光吸收的強弱與吸光物質(zhì)的濃度與厚度間關(guān)係的定律。吸收係數(shù)可用於定性定量。百分吸收係數(shù)：指在一定波長下，溶液濃度為1%（W/V,g/ml）,溶液厚度為1cm時的吸光度．摩爾吸收係數(shù)ε：指在一定波長下，溶液濃度為1mol/L,溶液厚度為1cm時的吸光度.ε=(M/10)×

M為摩爾品質(zhì)吸光度的加合性：混合組分的吸光度是各組分吸光度的和。（三）定性依據(jù)

吸收光譜：最大吸收波長吸收係數(shù)兩波長處吸收度比值（四）影響測定準(zhǔn)確性的因素1．偏離Beer定律的因素光學(xué)因素：單色光不純，比色皿厚度的均勻度不合要求。

化學(xué)因素：若溶液為膠體溶液或混濁，則入射光通過溶液時部分光會散射或反射而損失；溶液中的溶質(zhì)因濃度改變而發(fā)生解離、締合、與溶劑相互作用等變化，使吸收發(fā)生改變，偏離Beer定律。2．透光率測定誤差來自儀器的噪音

可見，濃度相對誤差取決於透光率及其測量誤差的大小。A在0.2－0.7範(fàn)圍時，濃度測量值的相對誤差較小。二．紫外-可見分光光度計1．光源鎢燈和鹵鎢燈：發(fā)可見光氫燈和氘燈：發(fā)紫外光2．單色器3．吸收池光學(xué)玻璃吸收池：只能用於可見光區(qū)。熔融石英（氧化矽）吸收池：在紫外光區(qū)和可見光區(qū)都可用。4．檢測器常用光電倍增管、光二極體陣列檢測器（photo-diodearraydetector）三．UV-Vis分析方法（一）定性鑒別

UV-Vis一般採用對比法進行定性鑒別。將試樣的吸收光譜特徵與標(biāo)準(zhǔn)化合物的吸收光譜特徵進行對照比較。１．對比吸收光譜特徵數(shù)據(jù)２．對比吸收度或吸收係數(shù)的比值可消除溶液濃度和吸收厚度的影響。３．對比吸收光譜的一致性（二）純度檢查1．雜質(zhì)檢查2．雜質(zhì)的限量檢查：後面講（三）定量測定1．測定方法的建立（１）查文獻，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)確定有無紫外吸收（２）測定條件的選擇：通過測定吸收光譜，確定波長：一般選擇

max，以提高靈敏度並減少誤差；或無干擾且吸收度較大的峰對應(yīng)的波長；不選擇末端吸收波長。溶劑的選擇：（３）估算靈敏度，決定取樣量標(biāo)準(zhǔn)曲線線性範(fàn)圍的吸收度最好在0.2-0.7之間。（4）空白液：一般以空白體液的提取液為空白，消除體液中其他物質(zhì)的干擾。2．單組分的定量方法1）吸收係數(shù)法：單色光很純時採用

C=A/(εl)2）校正曲線法必須使用相同儀器，且固定工作狀態(tài)和測定條件，否則吸光度和濃度之間的關(guān)係就會偏離線性。３）對照法

Cx=(Ax/As)×Cs

Cs:標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。在相同儀器、相同波長下測定。標(biāo)準(zhǔn)物和試樣為相同物質(zhì)。３．同時測定多組分的定量方法

—計算分光光度法樣品中有兩種組分共存時，各組分吸收光譜相互重疊的程度主要三種：各組分的吸收峰處，其他組分沒有吸收：可按單組分的測定方法，分別在各自的吸收峰處測定。各組分的吸收光譜有部分重疊：可先在λ1處按單組分測定法測得混合溶液中a組分的濃度Ca，再在λ2處測定混合溶液的吸收度A2(a+b),則可根據(jù)吸收度的加和性計算組分b的濃度Cb.

A2(a+b)=A2a+A2b=E2a×Ca+E2b×Cb各組分的吸收光譜完全重疊（相互干擾）：最常見的情況。可採用以下方法測定。１）差示分光光度法（differencespectrophotometry）不需事先分離，能消除背景吸收和干擾物對供試液測定的影響。測定方法與原理：取兩份相等的供試液，製成兩種不同的化學(xué)環(huán)境（如在其一中加酸或堿，改變pH；或在其一中加入能與供試品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的試劑），供試品在不同的化學(xué)環(huán)境中以兩種不同的化學(xué)形式存在（如分子型與離子型，氧化型與還原型），且兩種化學(xué)形式的吸收光譜有顯著差異；而背景吸收和干擾物的吸收不受化學(xué)環(huán)境的影響。將兩份供試液稀釋到相同濃度，分別置於樣品池和參比池中，於適當(dāng)波長處測定吸收度的差值(?A)，即可對供試品進行定量。設(shè)x、y分別代表兩種不同化學(xué)環(huán)境中供試品的兩種不同化學(xué)形式，它們在測定波長處的吸收度以Ax和Ay表示；背景吸收和干擾物的吸收度為Az，則：?A=A樣品–A參比

=（Ax+Az）-(Ay+Az)=Ax–Ay=εxCL-εyCL=(εx–εy)CL具體測定方法有3種（見《體內(nèi)藥物分析》p82）：

1)利用最大吸收波長處的吸收度差定量；

2)利用最小吸收波長處的吸收度差定兩；

3)利用差示光譜中最大吸收與最小吸收之差定量。2)雙波長分光光度法一般用雙波長分光光度計測定。A.等吸收點雙波長法原理：以a、b兩組分為例。選擇兩個測定波長，使干擾組分a在兩波長處有等吸收，而待測組分在兩波長處的吸收度有顯著差別。測定混合物溶液在兩波長處的吸收度之差即可對待測組分進行定量。?A=Aλ2(a+b)-Aλ1(a+b)

=(Aλ2a+Aλ2b)-(Aλ1a+Aλ1b)=Aλ2b-Aλ1b=(ελ2b-ελ1b)CbL2)雙波長分光光度法B.係數(shù)倍率法當(dāng)干擾組分沒有等吸收波長或雖有等吸收波長而待測組分的?A較小時，等吸收點雙波長法則不能使用?？捎脗S數(shù)倍率法。原理：在選定的兩波長處，利用雙波長分光光度計的信號放大裝置，將一個波長處的吸收信號放大k倍，使干擾組分a在兩波長的吸收度相等,

即Aλ1a=kAλ2a。測定混合物溶液在兩波長處的吸收度之差即可對待測組分進行定量。?A=kAλ2(a+b)-Aλ1(a+b)=(kAλ2a+kAλ2b)-(Aλ1a+Aλ1b)=kAλ2b-Aλ1b=(kελ2b-ελ1b)CbL當(dāng)k=1時，即是等吸收點法。應(yīng)選擇使k值盡可能接近於1的波長對進行實驗。3）導(dǎo)數(shù)分光光度法A導(dǎo)數(shù)光譜的波型和特點零階光譜的極大在奇數(shù)階的導(dǎo)數(shù)光譜中相應(yīng)於0，在偶數(shù)階的導(dǎo)數(shù)光譜中相應(yīng)於極值（極大和極小交替出現(xiàn)）；零階光譜的拐點在奇數(shù)階的導(dǎo)數(shù)光譜中產(chǎn)生極值，在偶數(shù)階的導(dǎo)數(shù)光譜中相應(yīng)於0；隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)增加，極值數(shù)量增加（導(dǎo)數(shù)階數(shù)+1），譜帶邊窄，分辨能力提高。因此導(dǎo)數(shù)光譜在定性分析中十分有用。B消除干擾組分吸收的原理若干擾組分的吸收對波長呈線性，可用一階導(dǎo)數(shù)法消除干擾：

A總

=εCL+(aλ+b)dA/dλ=(dε/dλ)CL+a定量參數(shù)D=（dA/dλ）峰

-（dA/dλ）穀

=[（dε/dλ）峰

-（dε/dλ）穀]CL對給定波長，(dε/dλ)峰、(dε/dλ)穀為常數(shù)第三章螢光分析法

fluorometry一.概述

fluorometry是根據(jù)物質(zhì)螢光譜線的位置及強度進行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法。靈敏度比UV-Vis法高，但重現(xiàn)性不如UV-Vis法。光致發(fā)光：常見光致發(fā)光有螢光和磷光?；瘜W(xué)發(fā)光（Chemiluminescence,CL）：是指吸收了化學(xué)反應(yīng)能的原子或分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產(chǎn)生的一種光輻射現(xiàn)象。分子螢光：待測物質(zhì)是分子。原子螢光：待測物質(zhì)是原子。激發(fā)光：UV-Vis光，IR光，X-射線等

二．基本原理（一）分子螢光的產(chǎn)生1．振動弛豫vibrationalrelaxation：處於激發(fā)態(tài)各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的過程。振動弛豫屬於無輻射躍遷，因為能量不是以光輻射的形式放出的。2．內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換internalconversion：受激分子由高電子能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級的過程。3．外部能量轉(zhuǎn)換externalconversion:溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或與其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，並以熱能的形式釋放能量的過程。4．螢光發(fā)射：物質(zhì)分子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時，以輻射形式發(fā)射光量子，這些光量子就稱為螢光。由於振動弛豫、內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換和外部能量轉(zhuǎn)換損失了部分能量，故螢光的波長總比激發(fā)光波長長。

(二)激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜（excitationspectrum）：表示不同激發(fā)波長的光引起物質(zhì)發(fā)射某一波長螢光的相對效率。繪製激發(fā)光譜曲線時，固定發(fā)射單色器在某一波長，通過激發(fā)單色器掃描，以不同波長的光激發(fā)物質(zhì)，記錄螢光強度對激發(fā)光波長的關(guān)係曲線，即得激發(fā)光譜。類似於吸收光譜。發(fā)射光譜（或稱螢光光譜，fluorescencespectrum）：表示在所發(fā)射的螢光中，各種波長螢光組分的相對強度。繪製發(fā)射光譜時，使激發(fā)光的波長和強度保持不變，通過發(fā)射單色器掃描以檢測各種波長下相應(yīng)的螢光強度。記錄螢光強度對發(fā)射波長的關(guān)係曲線，即得螢光光譜。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可用於鑒別螢光物質(zhì)，且是選擇測定波長的依據(jù)。

(三)螢光效率

（fluorescenceefficency）即螢光量子效率，指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射螢光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比。φf=發(fā)射螢光的光子數(shù)/吸收螢光的光子數(shù)一般在0—1之間。(四)有機化合物分子結(jié)構(gòu)

與螢光的關(guān)係能發(fā)射螢光的物質(zhì)需同時具備2個條件：有強的紫外-可見吸收：具有π-π*躍遷的長共軛分子有；具有一定的螢光效率：有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子有。1.長共軛結(jié)構(gòu)與螢光的關(guān)係：含芳香環(huán)或芳香雜環(huán)的物質(zhì)具有長共軛的π-π*躍遷，能產(chǎn)生螢光。π電子共軛程度越大，則螢光強度越大，螢光波長也長移。

λex205nmλex286nmλem356nmλem278nmλem321nmλex404nmφf=0.11φf=0.29φf=0.362.分子的剛性與螢光的關(guān)係：在相同的長共軛分子中，分子的剛性越強，螢光效率越大，螢光波長越長。

φf=0.2φf=1.03.取代基與螢光的關(guān)係

給電子取代基：-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-NR2,-CN能增加分子的π電子共軛程度，螢光效率提高，螢光波長長移。吸電子取代基：-COOH,-NO2,-C=O,-NO,-F,-Cl,-Br,-I等。能減弱分子的π電子共軛程度，螢光效率減弱甚至熄滅。(五)螢光試劑與弱螢光物質(zhì)或不顯螢光的物質(zhì)作用，得到強螢光性衍生物。常用試劑：螢光胺，鄰苯二甲醛（OPA）,丹醯氯，丹醯肼，8-羥基喹啉（常用於無機離子的衍生）等。(六)影響螢光強度的外部因素1.溫度：一般，溫度升高，溶液中螢光物質(zhì)的螢光強度和螢光效率降低。因溫度升高，分子運動速度加快，分子碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加。2.溶劑極性:一般，溶劑的極性增加，螢光波長長移，螢光強度增加。因極性溶劑中，π-π*躍遷的能量差減小，使激發(fā)波長和螢光波長均長移，躍遷幾率增加，螢光強度增加。粘度：粘度減小，分子碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，螢光減弱。3.酸度：當(dāng)螢光物質(zhì)本身是弱酸或弱鹼時，溶液的酸度對其螢光強度影響較大。因螢光物質(zhì)有其最適宜的發(fā)射螢光的存在形式。苯胺：pH7-12,主要以分子形式存在，-NH2能提高螢光效率。發(fā)射藍色螢光。當(dāng)溶液的pH<2或pH>13時，以離子形式存在，不能發(fā)射螢光。4.螢光熄滅劑quenchingmedium：能與螢光物質(zhì)相互作用,使其螢光強度降低或熄滅的物質(zhì)。螢光熄滅劑會使螢光分析產(chǎn)生誤差。螢光熄滅法：如果一種螢光物質(zhì)在加入某種熄滅劑後，螢光強度的降低和螢光熄滅劑的濃度成線性關(guān)係，則可利用這一性質(zhì)測定螢光熄滅劑的含量。5.散射光：一束光照在溶液中時，與溶液中的物質(zhì)分子相互碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱散射光。又分為：瑞利光（Reyleighscatteringlight）：光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時，產(chǎn)生的散射光。其波長與入射光波長相同。拉曼光（Ramanscatteringlight）：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量，而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光，這種光稱拉曼光。散射光對螢光測定有干擾，尤其是比入射光波長更長的拉曼光，干擾更大。

三.螢光定量分析（一）定量原理

螢光強度正比於被螢光物質(zhì)吸收的光強度：F=K(I0-I)根據(jù)beer定律：I=I010-ECL,則F=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL)=KI0[1-(1++++……)]=KI0[2.3ECL---…)]當(dāng)濃度很小時（即當(dāng)ECL

0.05時），上式簡化為：

F=2.3KI0ECL

即低濃度時，溶液的螢光強度與螢光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)係。且與受下列因素的影響：螢光量子效率；入射光強度；化合物的吸收係數(shù)。（二）定量方法1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法：以空白溶液調(diào)0（螢光強度為0），以標(biāo)準(zhǔn)系列中最大濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)100%（螢光強度為100%）。2．對照法：若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過0點，可用對照法定量。

Cx=×Cs當(dāng)空白溶液的螢光強度不能調(diào)到0時，必須扣出。四．螢光分光光度計1．激發(fā)光源：汞燈，氙燈，鐳射2．濾光片：2個，激發(fā)濾光片位於光源和樣品池之間；螢光濾光片位於樣品池和檢測器之間。3．樣品池4．檢測器：PMT收集螢光的方向:與激發(fā)光源的方向垂直五．測定方法的建立1．根據(jù)文獻及結(jié)構(gòu),判斷物質(zhì)的螢光性質(zhì)2．作激發(fā)光譜和螢光光譜，選擇最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長3．定性方法：比較待測組分與標(biāo)準(zhǔn)品的最大發(fā)射波長、螢光強度、螢光光譜等。3．定量方法：一.概述重要性:

歷史上兩次諾貝爾化學(xué)獎都直接與色譜研究相關(guān)1948年瑞典科學(xué)家Tiselins因電泳和吸附分析的研究獲獎；1952年英國的Martin和Synge因發(fā)展了分配色譜獲獎。色譜法的創(chuàng)建:色譜法創(chuàng)始於20世紀(jì)初，1903年由俄國植物學(xué)家Tsweet發(fā)現(xiàn),並於1906年發(fā)表論文,將這種方法命名為“色譜”。二.色譜法分類1.按流動相與固定相的分子集聚狀態(tài)分：流動相可為氣體、液體和超臨界流體；固定相可為液體和固體；以化學(xué)鍵合固定相進行的色譜法稱為鍵合相色譜法。2.按操作形式分：柱色譜法，平面色譜法，毛細(xì)管電泳法等3.按色譜過程的分離機制分：分配色譜法，吸附色譜法，離子交換色譜法，空間排阻色譜法，CE,CEC等.三．基本原理和概念（一）色譜過程實現(xiàn)色譜操作的基本條件：必須具備相對運動的兩相，即：固定相（stationaryphase）：固定不動；流動相（mobilephase）：攜帶試樣向前移動的流動體。色譜過程：組分分子在流動相和固定相間多次分配的過程。（二）色譜流出曲線和有關(guān)概念1．色譜流出曲線和色譜峰1）色譜流出曲線：由檢測器輸出的回應(yīng)信號對時間作圖所得到的曲線，即色譜圖。2）基線：在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線。反映儀器（主要是檢測器）的噪音隨時間的變化。3）色譜峰：正常峰：對稱形正態(tài)分佈曲線。拖尾峰（tailingpeak）：前沿陡峭，後沿平緩。前延峰（leadingpeak）：後沿陡峭，前沿平緩。對稱因數(shù)fs(symmetryfactor)或拖尾因數(shù)（tailingfactor）:fs=W0.05h/2A=(A+B)/2AW0.05h為0.05倍色譜峰高處的色譜峰寬。A,B分別為0.05倍色譜峰高處的色譜峰前沿、後沿與色譜峰頂點至基線的垂線之間的距離。fs=0.95-1.05對稱峰;小於0.95為前延峰;大於1.05為拖尾峰.描述色譜峰的參數(shù)：峰高和峰面積：用於定量；保留值：定性；峰寬：衡量柱效。2．保留值1）保留時間（retentiontime,tR）：從進樣到某組分在柱後出現(xiàn)濃度極大時的時間間隔。2）死時間(deadtime,t0)：不被固定相吸附或溶解的組分的保留時間。3)調(diào)整保留時間（adjustedretentiontime,t’R）:t’R=tR–t04)保留體積（retentionvolume,VR）:從進樣到某組分在柱後出現(xiàn)濃度極大時,所需通過色譜柱的流動相體積。

VR=tR×Fc流動相流速（體積流速，ml/min）越大，保留時間越短，二者的乘積不變，即VR與流動相流速無關(guān)。5）死體積（deadvolume,V0）:

從進樣器至檢測器的流路中未被固定相佔有的空間。是色譜柱中固定相顆粒間間隙、進樣器到色譜柱間導(dǎo)管的容積、柱出口導(dǎo)管及檢測器內(nèi)腔容積的總和。

V0=t0×Fc

死時間相當(dāng)於流動相充滿死體積所需的時間。6）調(diào)整保留體積（adjustedretentionvolume,V’R）7)相對保留值（relativeretention,rorα）:

色譜系統(tǒng)的選擇性指標(biāo)。8）保留指數(shù)（retentionindex,I）

GC中，把組分的保留行為換算成相當(dāng)於正構(gòu)烷烴的保留行為，即以正構(gòu)烷烴作為組分相對保留值的標(biāo)準(zhǔn)，用2個保留時間緊鄰待測組分的基準(zhǔn)物質(zhì)來標(biāo)定組分，這個相對值稱保留指數(shù)。又稱Kovats指數(shù)。

Ix=100[z+n]z和z+n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù),n一般為13．色譜峰高和峰面積1）peakheight,h2)peakarea,A4.色譜峰區(qū)域?qū)挾?）標(biāo)準(zhǔn)差（standarddeviation,σ）:0.607倍峰高處的峰寬之半。2）半峰寬（peakwidthathalfheight,W1/2）

W1/2=2.355σ3)峰底寬（peakwidth,W）:通過色譜峰兩側(cè)拐點作切線，在基線上所截得的距離

W=1.699W1/2=4σ5.分離度(resolution,R)R=R=1.5時，兩峰完全分開，稱基線分離。（三）分配係數(shù)與色譜分離1．分配係數(shù)和容量因數(shù)分配係數(shù)（distributioncoefficient,K）:

在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相和流動相中的濃度之比

K=Cs/CmK與組分、固定相和流動相的性質(zhì)和溫度有關(guān)。在固定相、流動相和溫度一定時，K是組分的特徵參數(shù)。容量因數(shù)（capacityfactor,k）在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相和流動相中的品質(zhì)之比

k=ms/mm=(CsVs)/(CmVm)=K×(Vs/Vm)2．K和k與保留時間的關(guān)係設(shè)流動相的線速度為u，樣品組分的速度為v，將二者之比稱為保留比:R’=v/u(1)

在定距展開的柱色譜中，v=L/tR,u=L/t0,則：

R’=t0/tR(2)

因t0近似於組分在流動相中的時間tm，溶質(zhì)分子只有出現(xiàn)在流動相中時才能隨流動相前移故保留比與溶質(zhì)分子在流動相中的分?jǐn)?shù)有關(guān)：R’=R’=(3)由（2）和（3）式，得：tR=t0(1+k)(4)tR=t0(1+K)(5)(5)式為色譜過程方程，表示保留時間與分配係數(shù)的關(guān)係容量因數(shù)與保留時間的關(guān)係：

k=3．色譜分離的前提兩組分A和B:tRA=t0(1+KA)tRB=t0(1+KB)

?tR=tRA-tRB=t0(KA–KB)兩組分如果被分離，保留時間必須不等，則兩組分的K必須不等，-------色譜分離的前提。或?tR=tRA-tRB=t0(kA–kB),即容量因數(shù)不等是分離的前提。四．基本類型色譜方法及其分離機制（一）分配色譜法分離原理：利用被分離組分在固定相或流動相中的溶解度差別進行分離

K=Cs/Cm=(Xs/Vs)/(Xm/Vm)Xs:溶解在固定相中的組分溶質(zhì)分子

Xm:溶解在流動相中的組分溶質(zhì)分子包括：氣液分配色譜法;液液分配色譜法(正相分配色譜和反相分配色譜)（二）吸附色譜法分離原理：利用被分離組分對固定相表面吸附中心吸附能力的差別進行分離。吸附過程是組分分子和流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心的