蛋白質(zhì)含量測定方法的研究-2

實驗一蛋白質(zhì)含量測定方法的研究一、研究背景蛋白質(zhì)是生物的重要組成部分，在人類發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)后一直沒有停下過研究得腳步。在實驗室提取蛋白質(zhì)的過程中，目標蛋白質(zhì)的來源是廣泛的，而不同的樣品中目標蛋白質(zhì)的含量是不同的，為了得到更多的目標蛋白，就需要了解樣品中蛋白質(zhì)的含量。在實際的生活中也需要運用蛋白質(zhì)含量的測定，例如牛奶、奶粉中蛋白質(zhì)含量。記得前幾年轟動一時三聚氰胺事件，國家的標準蛋白質(zhì)檢測方法被不法分子所利用，通過蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷來謀取暴利。目前常用的蛋白質(zhì)檢測方法有五種：凱式定氮法、Folin-酚法、考馬斯亮藍法、紫外法、雙縮脲法。不同的方法有不同的優(yōu)缺點。二、研究目標通過四種不同的蛋白質(zhì)測定方法了解各種方法的優(yōu)缺點。在不同的條件下，能選擇正確的測定方法，從而獲得正確的數(shù)據(jù)。三、研究策略根據(jù)資料可以知道四種方法的局限性，針對這一個單一的變量設計五組實驗。一個是標準對照組，其他四組分別在標準組的基礎上引入一種變量。用四種方法分別測定五種溶液。在對同一種溶液的測定結(jié)果中，必有一種方法的結(jié)果和其他的結(jié)果有顯著差異，同時與標準液的結(jié)果也有顯著的差異。我們就認為這組溶液中的變量對于該蛋白質(zhì)測定的方法影響較大。四、研究方案及可行性分析研究方案：1、配置一組濃度梯度的標準液，分別用四種方法測定，并建立標準曲線。2、配置五種等濃度的樣品蛋白質(zhì)溶液并編號ABCDE。在配置過程中，A組加10毫升蒸餾水；B組加10毫升嘌呤溶液；C組加入10毫升EDTA溶液；D組加入10毫升雙氧水溶液；E組加入10毫升鹽酸溶液。3、分別用四種方法測定五種蛋白質(zhì)溶液。4、分析結(jié)果可行性分析：更具已有資料設計了四個單一的變量，分別針對四種實驗的缺點，同時保證沒有其他的變量。預期結(jié)果：在每組實驗的結(jié)果中分別有一個數(shù)據(jù)是在橫向和縱向上都有顯著差異的。我們可以確定這個變量對該實驗有很大的影響。五、具體實驗設計建立標準曲線紫外法a.儀器：紫外分光光度儀、移液管、試管和試管架試劑：標準牛血清蛋白溶液b.主要步驟試管號12345678標準蛋白質(zhì)液dH2O(ml)蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)OD2800400.53.50.1251.03.00.251.52.50.3752.02.00.502.51.50.6253.01.00.753.501.0按照上表分別向沒知識觀眾加入各種試劑，混勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm下測其光密度值。以OD值為縱坐標，繪制標準曲線。雙縮脲法a.儀器：分光光度計，分析天平，振蕩機刻度吸管，具塞三角瓶，漏斗試劑：雙縮脲試劑，0.05mol/L的NaOH，標準酪蛋白溶液配制成5mg/ml的溶液b.主要步驟試劑管號123456標準酪蛋白溶液(ml)00.20.40.60.81.0dH2O(ml)10.80.60.40.20雙縮脲試劑(ml)444444蛋白質(zhì)含量(mg/ml)012345震蕩15min，室溫靜置30min，540nm比色，以蛋白含量(mg/ml)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。Folin-酚法a.儀器：722型分光光度計，恒溫水浴，具塞刻度吸管15ml*8，小燒杯*2，漏斗及架，分析天平，移液管（0.5ml*1,1ml*2,5ml*1），容量瓶（50ml*1），研缽試劑：試劑甲（A:10g碳酸鈉，2g氫氧化鈉，0.5g酒石酸鉀鈉溶液溶解后蒸餾水定容至500ml；B:0.5g五水硫酸銅溶解后，蒸餾水定容至100ml；使用前將A與B按50:1比例混合，混合液有效期1天），試劑乙（1.5L磨口回流器中加入100g鎢酸鈉和25g鉬酸鈉及700ml蒸餾水，再加入50ml85%的磷酸，100ml濃鹽酸充分混合，小火回流10h結(jié)束后加入150g硫酸鋰，50ml蒸餾水及數(shù)滴溴，開口沸騰15min。稀釋至1L，過濾，使用時加入大約一倍的水），牛血清蛋白標準溶液，在分析天平上精確稱取0.0250g結(jié)晶牛血清蛋白，溶解后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，配成標準液（250μg/ml）。b.主要步驟管號123456標準BSA(ml)00.20.40.60.81.0蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20蛋白質(zhì)含量(μg/ml)050100150200250根據(jù)上表配好溶液，以后各加試劑甲5ml，混合后在室溫下放置10min，再加入0.5ml試劑乙（要立即混勻）。半小時后以不含蛋白質(zhì)的1號管為對照，用722型分光光度計計于650nm的波長下比色，記錄消光值。以消光值為縱坐標，牛血清蛋白含量為橫坐標，繪制曲線?？捡R斯亮藍G-250法a.儀器：721或722型分光光度計，離心機，分析天平（萬分之一），藥物天平，量筒10ml*1，研缽，燒杯，量瓶10ml*1，刻度吸管1ml*2,0.1ml*2，具塞刻度試管10ml*4，漏斗及架，剪刀試劑：牛血清蛋白，考馬斯亮藍G250，乙醇b.主要步驟（1）0-100μg/ml標準曲線的制作取6支試管，按下表數(shù)據(jù)配制成標準溶液各1ml管號123456100μg/ml牛血清蛋白標準液(ml)00.20.40.60.81.0蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20蛋白質(zhì)含量(μg/ml)020406080100準確吸取所配置的溶液1ml，分別放入10ml的具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍G250蛋白試劑，蓋塞，將試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用10mm光徑的比色杯在595nm下比色，做出標準曲線。（2）0-1000μg/ml標準曲線的制作管號7891011121000μg/ml牛血清蛋白標準液(ml)00.20.40.60.81.0蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20蛋白質(zhì)含量(μg/ml)02004006008001000與步驟（1）操作相同，做出0-1000μg/ml標準曲線。測定待測液蛋白質(zhì)含量紫外法a.配置相同濃度的待測液5個并編號ABCDE。在配置過程中，A組加10毫升蒸餾水；B組加10毫升嘌呤溶液；C組加入10毫升EDTA溶液；D組加入10毫升雙氧水溶液；E組加入10毫升鹽酸溶液。b.分別取待測液ABCDE1ml，加入蒸餾水3ml混勻，測其OD280，然后再標準曲線上查出待測液的蛋白質(zhì)濃度。c.測定OD280和OD260，并計算OD280/OD260的比值，根據(jù)校正數(shù)據(jù)表查出此時的校正因子。d.將原始數(shù)據(jù)代入經(jīng)驗公式：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*DOD280為該溶液在280nm下的紫外吸收，d為石英比色杯的厚度(cm)，D為溶液稀釋倍數(shù)。e.計算此時蛋白濃度與未加入干擾時的相對誤差，確定是否有明顯影響。雙縮脲法a.將磨碎的樣品在80℃條件下烘干至恒重。取出至于干燥器中冷卻待用。b.稱取烘干的樣品約0.2g兩份，分別放入兩個干燥三角瓶中。然后再個瓶中分別加入5ml0.05mol/L的氫氧化鈉潤濕，之后再加入20ml的雙縮脲試劑，震蕩15min，室溫中靜置30min，分別過濾，取濾液在540nm波長下比色。在標準曲線上查出相應的蛋白質(zhì)含量(mg)。c.稱取烘干的樣品約0.2g四份，配置五種等濃度的樣品蛋白質(zhì)溶液并編號BCDE。在配置過程中，B組加10毫升嘌呤溶液；C組加入10毫升EDTA溶液；D組加入10毫升雙氧水溶液；E組加入10毫升鹽酸溶液。測定每一份的蛋白含量d.將原始數(shù)據(jù)e.代入公式：樣品蛋白含量（%）=從標準曲線上查得的蛋白含量（mg）/樣品重*100*酪蛋白純度。Folin-酚法a.分別稱取綠豆芽下胚軸1g于研缽內(nèi)，加入適量石英砂，勻漿，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，定容過濾。獲得樣品液。配置相同濃度的待測液5個并編號ABCDE。在配置過程中，A組加10毫升蒸餾水；B組加10毫升嘌呤溶液；C組加入10毫升EDTA溶液；D組加入10毫升雙氧水溶液；E組加入10毫升鹽酸溶液。b.取具塞試管兩支，分別加入1ml濾液，分別加入試劑甲5ml，混合均勻后放置10分鐘。然后各加試劑乙0.5ml，迅速混勻，室溫下放置30min，于650nm波長下比色，記錄吸光值，取平均值完成計算。原始數(shù)據(jù)代入公式：樣品蛋白含量（%）={[蛋白含量(μg/ml]*樣品總體積(ml)]/[樣品重(g)*106]}*100%，比較在迅速混合的條件下和有時間間隔的條件下的相對誤差?？捡R斯亮藍法a.稱取3g新鮮綠豆芽下胚軸，放入研缽中，滴加適量蒸餾水研成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管仲，放置30min-60min，在4000轉(zhuǎn)/分離心20min，過濾沉淀，上清液轉(zhuǎn)入容量瓶，以蒸餾水定容至50ml。配置相同濃度的待測液5個并編號ABCDE。在配置過程中，A組加10毫升蒸餾水；B組加10毫升嘌呤溶液；C組加入10毫升EDTA溶液；D組加入10毫升雙氧水溶液；E組加入10毫升鹽酸溶液。b.吸各個取待測液1ml做一個平行，放入具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍G250，充分混合，放置2min后用10mm光徑比色杯在595nm下比色，記錄消光值，以標準曲線1號試管做空白。c.原始數(shù)據(jù)代入公式，樣品蛋白含量=A*(提取液總體積/測定取用體積)/樣品重(g)，計算相對誤差。3.預期原始數(shù)據(jù)記錄紫外法分組ABCDE吸光度雙縮脲法分組A1A2BCDE吸光度Folin-酚法分組ABCDE吸光度考馬斯亮藍法分組空白組ABCDE吸光度六、質(zhì)疑及相關(guān)思考1.四個變量并不一定是最具有代表性的。2.ABCDE各組加入的試劑量有待商榷，加入的試劑濃度