核酸檢測(cè)原理及血站流程

1核酸檢測(cè)技術(shù)及

血站檢測(cè)核酸流程應(yīng)用支持中心曲賢敏

2015年1月核酸檢測(cè)技術(shù)核酸是什么,為什么要檢測(cè)核酸是如何被檢測(cè)到的核酸檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)(現(xiàn)對(duì)于ELISA)核酸檢測(cè)前提病毒是什么

1.由一種核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)構(gòu)成

HBVDNAHCVRNAHIVRNA 2.僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成（如朊病毒)

核酸是如何檢測(cè)的病毒核酸有病毒外殼(提取核酸)進(jìn)行擴(kuò)增至檢出水平(擴(kuò)增)擴(kuò)增時(shí)增加熒光標(biāo)記(熒光定量)檢測(cè)熒光量(結(jié)果)5靈敏度HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml特異性核酸的特異性高，幾乎沒(méi)有方法學(xué)假陽(yáng)性但要防止污染內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對(duì)照）為避免假陰性，要求每管陽(yáng)性質(zhì)控自動(dòng)化大規(guī)模、高通量核酸檢測(cè)的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)靈敏度宣傳靈敏度是指單人份的檢測(cè)實(shí)際靈敏度=宣傳靈敏度*Pooling數(shù)靈敏度是IU單位,其他無(wú)可比性HCV,HIV窗口濃度高,要求靈敏度比HBV要低與取樣幾率有很大關(guān)系(低病毒濃度)內(nèi)標(biāo)控制內(nèi)標(biāo)的定義(InnerControl)人工合成的小段DNA片段,隨樣本一起進(jìn)行提取擴(kuò)增.內(nèi)標(biāo)作用內(nèi)標(biāo)是PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的必需成分,防止假陰性,提高檢測(cè)靈敏度的重要指示.內(nèi)標(biāo)會(huì)對(duì)整個(gè)核酸檢測(cè)過(guò)程的一個(gè)監(jiān)控,包括樣本的提取,熒光擴(kuò)增,及反應(yīng)液的配制,PCR的抑制因素等.內(nèi)標(biāo)與ELISA的陰陽(yáng)性對(duì)照有區(qū)別8

病毒變異免疫靜默期實(shí)驗(yàn)操作失誤病毒感染的窗口期項(xiàng)目ELISA窗口期項(xiàng)目NAAT窗口期HBsAg56HBV25抗-HCV72HCV59抗-HIV22HIV11核酸對(duì)比酶免優(yōu)點(diǎn)血站核酸檢測(cè)流程標(biāo)本采集標(biāo)本保存標(biāo)本制備核酸提取核酸擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果分析標(biāo)本采集保存采血車上采血之后,立即進(jìn)行冷凍離心HCV半衰期只有4小時(shí)2-8度保存上機(jī)前再次離心核酸提取

(磁珠法)樣本匯集(有/沒(méi)有)裂解結(jié)合洗滌磁珠加熱洗脫匯集什么是匯集為什么要匯集匯集的優(yōu)缺點(diǎn)裂解結(jié)合細(xì)胞裂解：破碎細(xì)胞膜及核膜.病毒裂解:破碎病毒外殼(蛋白質(zhì)).核酸結(jié)合:pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合

洗滌磁珠洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離.

干擾物通常是血液中的其他蛋白質(zhì)洗滌最后一步通常為酒精,干燥或者純水沖洗.洗脫核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來(lái)。(不完全被洗脫)洗脫液量比較少的情況下,洗脫效率會(huì)略提高.擴(kuò)增檢測(cè)檢測(cè)三項(xiàng)(多重,單項(xiàng))PCR/TMA PolymeraseChainReaction TranscriptionMediatedAmplification分析數(shù)據(jù)TMATMA與PCR比較結(jié)果判讀一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。CTCT值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)此數(shù)值由廠家經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)測(cè)定.問(wèn)題血站檢測(cè)為什么無(wú)TP?血站大部分用匯集?如何理解核酸