TNAIA 0253-2023 牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防控技術(shù)規(guī)程

ICSICS65.020.30ICSCCSA031

T/NAIA團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/NAIA0253-2023牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防控技術(shù)規(guī)程TechnicalprotocolforthediagnosisandpreventionofClostridiumperfringensofbovine2023-12-18發(fā)布 2023-12-31實(shí)施寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì) 發(fā)布T/NAIA0253-2023T/NAIA0253-2023前言GB/T1.1-20201定起草。本文件由寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所、寧夏大學(xué)、寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院、賀蘭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、同心縣科技服務(wù)中心。毛磊、施安、康曉冬、高?；邸埦帽P(pán)、于有利。本文件為首次發(fā)布。牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防控技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防控技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、診斷和防控措施。本文件適用于牛場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌病的綜合防控。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.13食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB18596畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。Clostridiumperfringen又名魏氏梭菌（Clostridium為梭狀芽胞桿菌屬，是厭氧、無(wú)動(dòng)力、能產(chǎn)生芽胞的蘭氏陽(yáng)性飲水而引起動(dòng)物感染發(fā)病。Clostridiumperfringentoxins產(chǎn)氣莢膜梭菌引起動(dòng)物發(fā)病的因素主要由其分泌的毒素所致，根據(jù)其產(chǎn)生的毒素種類α、β、ι、ε、CPE、NetB，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A~G七種類型，其中對(duì)人和動(dòng)物致病的主要是Ａ型（產(chǎn)生α毒素，部分菌株還產(chǎn)生腸毒素CPE），主要引起食物中毒和壞死性腸炎，甚至可以引起腸毒血癥，造成重大影響。洶涌發(fā)酵（stormyfermentation）產(chǎn)氣莢膜梭菌在牛奶培養(yǎng)基中能分解乳糖產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時(shí)產(chǎn)生大量氣體，將凝固的酪蛋白沖成蜂窩狀，并將液面上的凡士林層向上推擠，甚至沖開(kāi)管口，氣勢(shì)兇猛，是此菌的特征。爛 爛診斷流行病學(xué)飲食改變以及天氣變化而發(fā)生變化菌群大量繁殖并產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，致使動(dòng)物發(fā)病。臨床癥狀胃和網(wǎng)胃積食嚴(yán)重，皺胃嚴(yán)重?cái)U(kuò)張。病理變化黑色稠狀液體。病原學(xué)檢測(cè)樣本采集按照NY/T541規(guī)定執(zhí)行。分離培養(yǎng)（0.5cm×0.5cm×0.535%脫纖維羊血的豆粉固體培養(yǎng)基（A.1）3個(gè)產(chǎn)氣莢膜梭菌顯色培37℃24h℃24h溶血；梭菌顯色培養(yǎng)基上出現(xiàn)若干單個(gè)橙紅色菌落。顯微鏡觀察藍(lán)紫色、單個(gè)或者成對(duì)排列的革蘭氏陽(yáng)性菌。牛乳洶涌發(fā)酵5%脫纖維羊血固體培養(yǎng)基上的單菌落，加入含鐵牛乳培養(yǎng)基（A.2）中，將凡士林37℃24h的凡士林向上推擠，氣勢(shì)兇猛，呈現(xiàn)出“洶涌發(fā)酵”的現(xiàn)象。PCR鑒別診斷PCR擴(kuò)增模板制備取液體培養(yǎng)物2mL，12000r/min離心2min，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)菌體沉淀進(jìn)行基因組DNA的提取。PCR引物及退火溫度表1毒素基因的PCR擴(kuò)增引物序列 基因引物引物序列(5’→3’)片段大小/bp退火溫度/℃Cpacpa-FGCTAATGTTACTGCCGTTGA32552.6cpa-RCCTCTGATACATCGTGTAAGCpbcpb-FACTATACAGACAGATCATTCAACC23652.6cpb-RTTAGGAGCAGTTAGAACTACAGEtxetx-FAGTATCTAATGAAATGTCCATTCC58552.6etx-RACTTACTTGTCCTACItxitx-FACTACTCTCAGACAAGACAG44552.6itx-RTTTCCTTCTATTACTATACGnetBnetB-FATTATGTTTAGGAATACAGTTA74154netB-RCAATACCCTTCACCAAATACTCCpecpe-FGGAGATGGTTGGATATTAGG23354cpe-RGGACCAGCAGTTGTAGATAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物處理PCR1%DL1000DNAV35min左右，用凝膠成像系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。結(jié)果判定爛 爛符合4.1、4.2和4.3的特征判斷為疑似病例。4.44.5的特征判斷為確診病例。4.5.3CpaACpa、Cpb、EtxBCpaCpbC型產(chǎn)氣莢CpaEtxDCpaItxE型產(chǎn)氣莢膜CpaCpeFCpanetBG型產(chǎn)氣莢膜梭菌。防控措施疫苗接種防疫成年牛春秋季節(jié)采用牛產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防；犢牛斷奶后采用牛產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理3%5%GB1859616548的要求進(jìn)行無(wú)害化處理。附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基配制A.15%脫纖維羊血豆粉固體培養(yǎng)基1