DB21-T 2981-2018日本落葉松SRAP分析技術(shù)規(guī)程_第1頁
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文檔簡介

ICS65.020.01

B60

備案號:60599-2019DB21

遼寧省地方標準

DB21/T2981—2018

日本落葉松SRAP分析技術(shù)規(guī)程

TechnicalRegulationsforSRAPanalysisinLarixkaempferi

前言

本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標準由遼寧省林業(yè)廳提出并歸口。

本標準起草單位:遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院。

本標準主要起草人:王騫春、馮健、于世河、卜鵬圖、陸愛君、汪成成、張素清、陳罡、楊鶴、高英

旭、顏廷武、崔雪、丁彪、潘福民、鄭穎、王嘉、高宇、陳波、李程、趙濟川。

本標準的附錄A,附錄B,附錄C和附錄D為規(guī)范性附錄。

III

DB21/T2981—2018

日本落葉松種子園遺傳多樣性的SRAP分析技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了以日本落葉松SRAP分析的定義、術(shù)語、分析原理、儀器設(shè)備和實驗引物、反應(yīng)程序。

本標準適用于日本落葉松的SRAP分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T13016-2009標準體系表編制原則和要求

DB21/T2589-2016東部白松種源相關(guān)序列多態(tài)性(SRAP)分子鑒定實驗方法

3定義與術(shù)語

下列定義與術(shù)語適用于本標準。

3.1相關(guān)序列多態(tài)性sequence-relatedamplifiedpolymorphism;SRAP

利用1對引物設(shè)計對開放閱讀框(openreadingframes,ORFs)進行擴增,因個體不同以及物種

的內(nèi)含子、啟動子與間隔序列長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。

3.2引物primer

一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復(fù)制的起始點,在核酸合成反應(yīng)時,作為每個多核苷酸鏈進行延伸

的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈。

3.3聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction;PCR

在耐熱DNA聚合酶作用下,于體外快速大量特異擴增待定DNA序列的方法。

3.4引物擴增多態(tài)性primeramplifiedpolymorphism

1對引物在兩個或兩個以上不同材料基因組DNA之間擴增,得到數(shù)目不同或長度不同的DNA片段。

4儀器和設(shè)備

4.1PCR擴增儀。

DB21/T2981—2018

4.2瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。

4.3非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)。

4.4凝膠成像系統(tǒng)和照相系統(tǒng)。

4.5超純水系統(tǒng)。

4.6低溫高速冷凍離心機。

4.7超微量紫外/可見分光光度計。

4.8高壓滅菌鍋。

4.9液氮罐。

4.10超低溫冰箱。

4.11高壓電泳儀及配套電泳槽。

4.12移液器。

5引物

引物相關(guān)信息見附錄A。

6試劑與溶液

6.1主要常規(guī)試劑見附錄B。

6.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑見附錄C。

6.3銀染試劑見附錄D。

7實驗程序

7.1實驗材料

選用日本落葉松新鮮針葉提取基因組DNA,選取適量樣品,裝入凍存管,液氮速凍,置冰箱(-70℃)

中保存?zhèn)溆谩?/p>

7.2DNA的提取

7.2.1取0.5g洗干凈的針葉,用滅菌剪刀剪成小段置1.5mL離心管中(約至0.1刻度線)。加適量

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和VC(抗壞血酸),再向離心管中加入液氮后用塑料研磨杵將針葉研磨成粉

末。

DB21/T2981—2018

7.2.2加入1ml0℃預(yù)冷的CTAB-free提取液,混勻,0℃冰浴10min,期間輕柔顛倒2次-3次,在

4℃下10000r/min離心10min,棄上清。若上清液黏稠,用CTAB-free提取液清洗1次。

7.2.3加入650μL65℃預(yù)熱的4×CTAB提取液,用無菌槍頭小心將其混勻,65℃水浴30min。

7.2.4加入等體積的氯仿:異戊醇(V:V)=24:1的抽提掖,輕柔顛倒離心管10min,使其混勻,10000r/min

離心10min。然后用去尖的移液器吸頭小心吸取450μL上清液至另一離心管中,重復(fù)此步驟1次-2

次,至白色中間層消失為止。

7.2.5加入2倍體積的冰冷無水乙醇,顛倒混勻,出現(xiàn)絮狀沉淀,-20℃放置2h。10000r/min離心10

min,棄上清液。

7.2.670%乙醇清洗2遍,風干后加入100μL滅菌TE緩沖液溶解沉淀。

7.3DNA濃度的檢測和定量

用TE緩沖液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量標準,

各取3μLλ-DNA分子量標準溶液和3μL7.1中提取的未知濃度DNA溶液,在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,穩(wěn)

壓90V,電泳緩沖液為1×TBE,325nm紫外燈下觀察,照相,通過與標準溶液的熒光進行比較估測未知

DNA的濃度。

將8.2中提取的DNA溶液取10μL后,在1.5mL離心管中用TE稀釋200倍,放入石英比色杯中,用紫

外分光光度計檢測,記下其在260nm和280nm的光密度值(OD值),按公式(1)計算出DNA的濃度及

OD260和OD280的比值。OD260/OD280在1.8~2.0之間。

D=OD260×n×50/1000

式中:

D—DNA的濃度,單位為納克每微升(μg/μL);

OD260—260nm下的光密度值;

n—稀釋倍數(shù)。

7.4PCR反應(yīng)

7.4.1PCR反應(yīng)體系

20μl反應(yīng)體系中,模板DNA為120ng,引物濃度為0.3μmol/L,dNTPs濃度為0.15mmol/L,Mg2+

濃度為1.5mmol/L,Taq酶濃度為1.0U。

7.4.2PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5min;前5個循環(huán):94℃變性1min,37℃退火1min,72℃延伸1min;后40個循

環(huán):94℃變性1min,50℃復(fù)性1min,72℃延伸1min;循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min,最后4℃保存。

7.4.3PCR產(chǎn)物的處理

PCR結(jié)束后,于20μL的反應(yīng)體系中加入4μL的上樣緩沖液,搖晃混勻后,備用。

DB21/T2981—2018

7.5聚丙烯酰胺凝膠的制備

7.5.1玻璃板的清洗

用洗滌劑及抹布擦洗玻璃板(長板和短板),隨后用自來水沖洗干凈,再將玻璃板用蒸餾水沖洗2

次,最后用無屑紙巾沾取無水乙醇擦拭2遍,置于通風櫥內(nèi)垂直晾干待用。

7.5.2膠槽裝配

7.5.2.1玻璃板的固定

將長板玻璃板平鋪于通風櫥內(nèi),邊條擦拭后置于玻璃板兩側(cè),隨后用短板玻璃板整齊地壓蓋住,確

認邊條與兩玻璃板均對齊后,將其放入封膠框中并用夾子固定在制膠板上。

7.5.2.2封膠

配制1%的瓊脂糖凝膠,徹底煮沸后用膠頭滴管吸取,沿底邊從左至右緩緩灌注入封膠框中,避免

出現(xiàn)氣泡,待瓊脂糖凝膠完全漫過玻璃板底部,停止灌注,待其室溫凝固后進行下一步操作。

7.5.3丙烯酰胺膠的配制

在50mL8%非變性聚丙烯酰胺儲備液中加入100μL10%過硫酸銨和200μL四甲基乙二胺

(TEMED),迅速輕輕混勻。

7.5.4灌膠

將固定有封好玻璃板的制膠板向后傾斜放置,配好的8%非變性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁緩

慢勻速倒入灌膠口中,避免出現(xiàn)氣泡,待膠剛要溢出灌膠口時停止灌膠,將梳子輕輕插入灌膠口中,室

溫凝固1h以上。

7.5.5上樣和電泳

待凝膠完全凝固后,將裝有凝膠的玻璃板輕輕從制膠板上取下,灌膠口向內(nèi)用夾子固定在電泳槽上,

使用1×TBE緩沖溶液灌注電泳儀的上下兩槽,使下槽溶液漫過封膠框,上槽溶液漫過灌膠孔。垂直緩

慢將梳子從灌膠口中拔出,并用1×TBE緩沖溶液清洗和整理樣品槽。使用200μL移液器從左至右逐個

對點樣孔進行吹打,直至點樣孔內(nèi)無碎膠、氣泡以及其他雜質(zhì)。取5μL處理后的PCR擴增產(chǎn)物上樣,

并在膠板的一側(cè)或適當位置的樣品槽中加入4μL的DNAMarker(DL2000Marker)作為對照,電泳在

200V穩(wěn)壓,電流300mA條件下進行,電泳時間約為2.5h~3h。

7.5.6卸膠

電泳結(jié)束,關(guān)閉電源,將上槽中1×TBE緩沖液放出,取下固定的夾子,將玻璃板水平放置,起膠

鏟一側(cè)沿灌膠口邊緣緩慢撬起,將緊貼有凝膠的玻璃板放入裝有雙蒸水的洗膠盤中,使凝膠與玻璃板分

離,取出玻璃板,放凈雙蒸水。

7.6銀染

DB21/T2981—2018

7.6.1固定

將取出的凝膠小心放入裝有1L新配制的10%冰乙酸(固定/終止液)的塑料方盒中,置于水平搖

床上80r/min輕搖10min。

7.6.2漂洗

將膠小心轉(zhuǎn)入雙蒸水中漂洗2次,每次2min,放凈雙蒸水。

7.6.3染色

在新配好的500mL硝酸銀溶液中加入1.6mL37%甲醛溶液,充分混勻后沿一角倒入裝有凝膠的方

盒中,水平搖床上80r/min輕搖10min后,放凈染色液。

7.6.4沖洗

在方盒中加入1L雙蒸水,脫色搖床上80r/min輕搖30s,倒凈雙蒸水。

7.6.5顯影

將2mL37%甲醛溶液加入提前4℃預(yù)冷的500mL氫氧化鈉溶液中,充分混勻后沿一角倒入方盒

中,水平搖床上80r/min輕搖至清楚條帶顯現(xiàn)。

7.6.6定影

將膠小心取出,用雙蒸水沖洗一次后迅速放入10%冰乙酸中,水平搖床輕搖3min~5min,放凈固

定液。

7.6.7漂洗

在雙蒸水中漂洗2次,每次2min。

7.6.8觀測

將凝膠輕輕放在白的透明的日光燈觀測箱上,用玻璃棒鋪平凝膠并趕出氣泡,觀察和記錄電泳結(jié)果,

用數(shù)碼相機進行拍照;或用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。

7.7譜帶記錄

選取電泳圖上清晰、易于辨認的多態(tài)性條帶進行記錄和統(tǒng)計,根據(jù)DNA分子量標準(DNAMarker)

計算出個擴增條帶相應(yīng)的DNA片段分子量大?。ń浦担?,以SRAP引物組合的名稱加上DNA片段分子量大

小為后綴對條帶進行命名,并分別用“1”和“0”代表“有”帶和“無”帶的方法仔細記錄,獲得DNA二維數(shù)據(jù)

矩陣。

DB21/T2981—2018

AA

附錄A

(規(guī)范性附錄)

SRAP(相關(guān)序列多態(tài)性)標記引物序列

表A.1所用SRAP(相關(guān)序列多態(tài)性)標記引物序列

引物編號序列(5'→3')引物編號序列(5'→3')

me1TGAGTCCAAACCGGATAem1GACTGCGTACGAATTAAT

me2TGAGTCCAAACCGGAGCem2GACTGCGTACGAATTTGC

me3TGAGTCCAAACCGGAATem3GACTGCGTACGAATTGAC

me4TGAGTCCAAACCGGACCem4GACTGCGTACGAATTTGA

me5TGAGTCCAAACCGGAAGem5GACTGCGTACGAATTAAC

me6TGAGTCCAAACCGGTAAem6GACTGCGTACGAATTGCA

me7TGAGTCCAAACCGGTCCem7GACTGCGTACGAATTCAA

me8TGAGTCCAAACCGGTGCem8GACTGCGTACGAATTCTG

me9TGAGTCCAAACCGGTAGem9GACTGCGTACGAATTCGA

me10TGAGTCCAAACCGGTCTem10GACTGCGTACGAATTCAG

em11GACTGCGTACGAATTCCA

DB21/T2981—2018

BB

附錄B

(規(guī)范性附錄)

主要試劑的配置

B.10.5mol/LEDTA-二鈉(pH8.0)溶液

將18.61g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA-2H2O)溶于80mLH2O中,加入氫氧化鈉(NaOH)調(diào)

節(jié)pH至8.0,用超純水定容至100mL,高壓滅菌,4℃保存。

B.21mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液

將24.22g三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶解于160mL水中,用濃鹽酸(HCl)調(diào)劑pH至8.0,用超

純水定容至200mL,高壓滅菌,4℃保存。

B.35mol/LNaCl溶液

將58.44g氯化鈉(NaCl)溶于160mL水中,定容至200mL,高壓滅菌,4℃保存。

B.4CTAB-free緩沖液

CTAB-free緩沖液的成分為250mmol/LNaCl、200mmol/LTris-HCl(1mol/LpH8.0)和50mmol/L

EDTA(0.5mol/LpH8.0)。在600mL水中加入14.6gNaCl,攪動溶解后,加入200mL1mol/LTris-HCl

(pH8.0)、100mL50mmol/LEDTA(pH8.0),定容至1000mL,高壓滅菌,4℃保存。

B.54×CTAB提取緩沖液

4×CTAB提取緩沖液的成分為4%(質(zhì)量濃度)溴代十六烷基三甲胺(CTAB)、100mmol/LTris-HCl

(1mol/LpH8.0)、20mmol/LEDTA(0.5mol/LpH8.0)和1.4mol/LNaCl(5mol/L)。在500mL去離

子水中加入40gCTAB,攪動溶解后。加入100mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)、40mL0.5mol/LEDTA

(pH8.0)和280mL5mol/LNaCl,定容至1000mL,高壓滅菌,4℃保存。

B.6TE(pH8.0)緩沖液

取1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,用水定容至100mL,高壓

滅菌,4℃保存。

B.7EB(1mg/mL)溶液

取0.05g溴化乙錠(EB)用50mL水溶解,用鋁箔或黑紙包裹容器,室溫保存,工作濃度

為1mg/mL。

B.810mol/LNaOH溶液

稱取80mg氫氧化鈉(NaOH),先用160mL水溶解后,在加水定容至200mL,高壓滅菌,室溫

保存。

B.90.8%瓊脂糖凝膠的配制

稱取0.8g電泳級瓊脂糖至于200mL三角瓶中,加入100mL1×TBE電泳緩沖液,在微波爐中熔化

至溶液透明(確保所有瓊脂糖顆粒均完全熔化),冷卻至50℃~60℃,加入EB(1mg/mL)溶液使其

終濃度為0.5μg/mL,混勻后倒入放好梳子(距底板約1mm)的載版上,凝膠厚度為3mm~5mm,待

DB21/T2981—2018

凝膠完全凝固后放入電泳槽中,然后向槽內(nèi)加入1×TBE稀釋緩沖液至液面剛好沒過膠版上表面。

B.106×DNA上樣緩沖液電泳(DNALordingBuffer)

6×DNALordingBuffer,其中含0.05%(質(zhì)量分數(shù))溴酚藍、0.05%(質(zhì)量分數(shù))二甲苯青、

30mmol/LEDTA、36%(質(zhì)量分數(shù))甘油和ddH2O。使用時按照每5μLDNA樣品加入1μLDNA上樣緩沖液

的比例,混合DNA樣品和DNA上樣緩沖液,直接加到點樣孔即可。

DB21/T2981—2018

CC

附錄C

(規(guī)范性附錄)

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑

表C.140%丙烯酰氨(acrilamide)貯備液

成分用量備注

丙烯酰氨(acrilamide)380g用400mL去雙蒸水加熱溶解

甲叉雙丙烯酰氨(bis-acrilamide)20g用200mL去雙蒸水溶解

最終體積1000mL棕色瓶中室溫保存

表C.210%過硫酸銨(ammoniumpersulphate)溶液

成分用量備注

過硫酸銨(ammoniumpersulphate)1g

雙蒸水(ddH2O)10mL分裝后-20℃保存。

表C.310倍三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸緩沖液(10×TBE緩沖液)

成分用量備注

Tris堿(Trisbase)108g

硼酸(boricacid)55g

0.5mol/LEDTA(pH8.0)40mL用雙蒸水定容至1000mL

最終體積1000mL室溫保存

表C.48%非變性聚丙烯酰氨工作液

成分用量備注

40%丙烯酰氨貯備液10mL現(xiàn)用現(xiàn)配

10×TBE5mL

雙蒸水(ddH2O)35mL

10%過硫酸銨(ammoniumpersulphate)100μL

四甲基乙二酸(TEMED)200μL

DB21/T2981—2018

DD

附錄D

(規(guī)范性附錄)

銀染試劑

表D.1固定/脫色液

成分用量備注

冰乙酸(glacialaceticacid)100mL臨時配制

雙蒸水(ddH2O)900mL

表D.2硝酸銀(AgNO3)染色液

成分用量備注

硝酸銀(AgNO3)3g

37%甲醛(formaldehyde)1.6mL

雙蒸水(ddH2O)500mL臨時配制,避光室溫保存

表D.2氫氧化鈉(NaOH)顯影液

成分用量備注

氫氧化鈉(NaOH)10g用前在4℃冰箱預(yù)冷30min。

37%甲醛(formaldehyde)2mL

雙蒸水(ddH2O)500mL臨時配制,避光室溫保存

_________________________________

目次

前言..............................................................................IV

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3定義與術(shù)語.........................................................................1

4儀器和設(shè)備......................................................................

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