DB21-T 3084-2018羽絨制品中鵝絨的鑒別 PCR法和實時熒光PCR法

ICS59.080

W59

備案號：62065-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3084—2018

羽絨制品中鵝絨的鑒別

PCR法和實時熒光PCR法

IdentificationofGooseDownFiberinFeatherandDownProducts

-PCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethod

DB21/T3084—2018

羽絨制品中鵝絨的鑒別PCR法和實時熒光PCR法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羽絨制品中鵝絨的PCR和實時熒光PCR鑒別方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于羽絨制品。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction

一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增法，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物

為延伸起點，以4種單核苷酸（dNTP）為底物，通過變性—退火—延伸的循環(huán)反應(yīng)，使極少量的DNA

的特定片段，在短短幾小時內(nèi)擴(kuò)增上百萬倍。

3.2實時熒光PCRreal-timefluorescencepolymerasechainreaction

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過曲線對未

知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

bp：堿基對（basepair）

Ct值：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cyclethreshold）

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

DTT：二硫疏糖醇

dNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

5原理

用試劑盒法或其他等效DNA提取法提取樣品中的DNA。針對鵝的線粒體DNA序列設(shè)計引物和探

針，通過單PCR、實時熒光PCR技術(shù)，對DNA中的鵝成分分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)實驗結(jié)果，判

定樣品中是否含有鵝絨。

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6試劑

6.1實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。

6.2組織和毛發(fā)提取試劑盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRa

Code.9765)。參見附錄A中A.1。

6.3PremixExTaq?(ProbeqPCR)(TaKaRaCode.RR390A)參見附錄A中A.2。

6.4100%乙醇。

6.5溴化乙錠溶液。

6.6DNALaddarMarker。

7設(shè)備與器具

7.1PCR儀

7.2實時熒光定量PCR儀

7.3電泳裝置

7.4凝膠成像儀

7.5冰箱：4℃~20℃

7.6天平：精度為0.0001g

7.7分析研磨機(jī)

7.8微孔干浴器或水浴鍋

7.9瞬時離心機(jī)

7.10渦旋混合器

7.111.5mL磁分離架

7.12微量可調(diào)移液器：0.1μL~2.5μL，1μL~10μL，2μL~20μL，10μL~100μL，20μL~200μL，

100μL~1000μL。

7.131.5mL離心管，2.0mL離心管

7.14PCR薄壁管

7.15實時熒光PCR光學(xué)反應(yīng)管

7.16超凈工作臺

8取樣

從羽絨服或其他羽絨制品的不同部位取樣，混合均勻后，再取約1g試樣。

9制樣

將樣品剪碎，經(jīng)分析研磨機(jī)打散混勻，再次盡量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨機(jī)混勻。

10DNA的提取

10.1組織裂解

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稱取約5mg試樣，放入2mL離心管中，每個樣平行提取2管，加入180μL的緩沖液GL（Buffer

GL）、20μL的蛋白酶K（ProteinaseK）和10μL的核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL），于56℃

水浴溫浴至組織完全裂解3小時。如殘存纖維狀組織無法完全裂解，裂解之后先12,000rpm離心2分

鐘，去除雜質(zhì)之后再進(jìn)行后續(xù)操作。向裂解液中加入200μL緩沖液GB（BufferGB）和200μL100%

乙醇，充分吸打混勻。

注：溫浴時可時常將樣品取出進(jìn)行振蕩或吸打以加速裂解。

10.2將核酸純化柱（SpinColumn）安置于收集管（CollectionTube）上，溶液移至核酸純化柱中，12,000

rpm離心2分鐘，棄濾液。

10.3將500μL的緩沖液WA（BufferWA）加入至核酸純化柱中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

10.4將700μL的緩沖液WB加入至核酸純化柱中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。

10.5確認(rèn)緩沖液WB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。

10.6沿核酸純化柱管壁四周加入緩沖液WB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。

10.7重復(fù)操作步驟4。

10.8將核酸純化柱安置于收集管上，12,000rpm離心2分鐘。

10.9將核酸純化柱安置于新的1.5mL的離心管上，在核酸純化柱膜的中央處加入50μL~200μL的

滅菌水或洗脫液（ElutionBuffer），室溫靜置5分鐘。

10.10將滅菌蒸餾水或洗脫液加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。

10.1112,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。如需獲得更大收量，可將離下液重新加入到核酸純化柱膜的

中央或再加入50L~200μL的滅菌水或洗脫液，室溫靜置5分鐘后，12,000rpm離心2分鐘洗脫DNA。

11DNA的鑒別

11.1質(zhì)量控制

進(jìn)行PCR、實時熒光PCR鑒別時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：擴(kuò)增鵝成分時

用鵝絨DNA。陰性對照：擴(kuò)增鵝成分時用非鵝絨DNA，空白對照：實驗用水。

11.2PCR法

11.2.1引物

所用引物信息見表1。

表1PCR擴(kuò)增所用引物

擴(kuò)增成分引物名稱引物序列退火溫度/℃產(chǎn)物大小/bp

Goose-cytb-F5’-GCTACTAGCCATACACTAC-3’60.3375

鵝

Goose-cytb-R5’-GTTGGATTGTCTACTGAGA-3’60.0375

11.2.2PCR反應(yīng)體系

premixExTaq(2×)12.5μL，10μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL，ddH2O8.5μL

11.2.3反應(yīng)條件

95℃，30s；95℃，5s，退火溫度（見表1），60℃，30s，40個循環(huán)。

注：不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。

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11.2.4PCR產(chǎn)物的檢測

將適量5×TBE稀釋成0.5×TBE溶液，配制2.0%瓊脂糖凝膠，取15μLPCR產(chǎn)物，點樣進(jìn)行電泳，

并加DNAmarker點樣以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電壓大小根據(jù)電泳槽長度來確定，一般控制在3

V/cm~5V/cm長度，電泳時間根據(jù)溴酚藍(lán)的移動位置來確定。電泳結(jié)束后，將凝膠置溴化乙錠溶液（10

μg/μL）中浸泡30min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照、記錄與分析電泳結(jié)果。

11.2.5PCR結(jié)果及判斷

陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶；待測樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小

的擴(kuò)增條帶，判斷結(jié)果為陰性。待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判斷結(jié)果為可疑陽性，需進(jìn)一

步確證。

11.2.6結(jié)果確證實驗

可疑陽性結(jié)果的采用實時熒光PCR法進(jìn)行確證。

11.3實時熒光PCR法

11.3.1引物及探針

所用的引物、探針見表2。

表2實時熒光PCR所用引物、探針

擴(kuò)增成分引物名稱引物序列退火溫度/℃產(chǎn)物大小/bp

Goose-cytb-F5’-GCTACTAGCCATACACTAC-3’60.3375

鵝Goose-cytb-R5’-GTTGGATTGTCTACTGAGA-3’60.0375

Goose-cytb-P5’-（FAM）CGCAGACACTTCACTCGCCT（Eclipse）-3’70.0375

11.3.2PCR反應(yīng)體系

PremixExTaq(2×)12.5μL，PremixExTaq(2×)12.5μL，PrimerF(10μM)1μL，Primer

R(10μM)1μL，Probe(5μM)1μL，DNA×2μL，dH2O7.5μL，×Negativecontrol反應(yīng)時，加入

RNasefreedH2O，×Positive反應(yīng)時，做2個平行樣。

11.3.3PCR反應(yīng)條件

95℃，30s；95℃，5s，退火溫度（見表2），60℃，30s，40個循環(huán)。

注：不同儀器可根據(jù)儀器要求和PremixExTaqTM使用說明書將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。

11.3.4結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍，基線范圍選擇在3~15個循環(huán)，如果有強(qiáng)陽性樣本，應(yīng)根據(jù)實

際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點，且Ct值=40為

準(zhǔn)。設(shè)置閾值后，分析樣品的檢測結(jié)果。

11.3.5結(jié)果判斷

待測樣品鵝成分檢測Ct值大于或等于40，內(nèi)參照基因檢測Ct值在23~30之間者，陰性對照、陽性

對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出鵝源性DNA成分。

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待測樣品鵝成分檢測Ct值小于或等于36，內(nèi)參照基因檢測Ct值在20~30之間者，陰性對照、陽性

對照和空白對照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出鵝源性DNA成分。

待測樣品鵝成分檢測Ct值在36~40之間，應(yīng)重做實時熒光PCR擴(kuò)增。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小

于40者，且陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出鵝源性DNA成分；再次

擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40，且陰性對照/陽性對照和空白對照結(jié)果正常，可判定該樣品未檢出鵝源性DNA

成分。

11.4結(jié)果表述

該樣品未檢出鵝源性DNA成分，

該樣品檢出鵝源性DNA成分。

12防止污染的措施

檢測過程中防止交叉污染的措施參照GB/T19495.2。

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AA

附錄A

（資料性附錄）

試劑盒

A.1試劑盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0(TaKaRaCode.9765)

組成（50次）

本試劑盒分試劑PartI與PartII兩部分。

PartI-20℃保存

蛋白酶K（proteinaseK，20mg/mL）1mL

核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）0.5mL

PartII室溫（15-25℃）保存

緩沖液GL（BufferGL）×112mL

緩沖液GB（BufferGB）×112mL

緩沖液WA（BufferWA）×128mL

緩沖液WB（BufferWB）×224mL

洗脫液（elutionbuffer）14mL

離心管（SpinColumns）50支

收集管（Collectiontubes）50支

A.2試劑盒PremixExTaq?(ProbeqPCR)(TaKaRaCode.RR390A)

組成（50μL反應(yīng)×200次）

PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×Conc.）×11.0mL×5支

ROXReferenceDye（50×Conc.）×2200μL×1支

ROXReferenceDyeII（50×Conc.）×2200μL×1支

非商業(yè)性聲明：附錄A所列參考試劑盒僅為提供參考，并不涉及商業(yè)目的，鼓勵標(biāo)準(zhǔn)使用者嘗試使

用不同廠家或型號的試劑盒及試劑。

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BB

附錄B

（資料性附錄）

擴(kuò)增產(chǎn)物序列

鵝擴(kuò)增產(chǎn)物序列（375bp）

Attcctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctga

atcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatt

tctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagccttcataggctatgtcctcccgtgaggcc

aaatatcattctgaggggccacagtaattacaaacttactatccgccatcccatacattgggacagacctagttcaatgaatctgagga

ggctactcagtagacagtcccac

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參考文獻(xiàn)

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