分子生物學(xué)-許曉東-4

4生物信息的傳遞（下）DNARNAproteinDNA:5’CGTGGATACACTTTTGCC3’編碼鏈、有意義鏈3’GCACCTATGTGAAAACGG5’模板連、反義鏈mRNA:5’CGUGGAUACACUUUUGCC3’PROTEIN:NArgGlyTyrThrPheAlaC轉(zhuǎn)錄transcriptionReverstranscription反轉(zhuǎn)錄翻譯translation翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開始，按每3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。蛋白質(zhì)是生物信息通路上的終產(chǎn)物，一個(gè)活細(xì)胞在任何發(fā)育階段都需要數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。因此，活細(xì)胞內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著各種蛋白質(zhì)的合成、修飾、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解反應(yīng)。細(xì)胞所用來進(jìn)行合成代謝總能量的90%消耗在蛋白質(zhì)合成過程中，而參與蛋白質(zhì)合成的各種組分約占細(xì)胞干質(zhì)量的35%。真核細(xì)胞中：70種以上的核糖體蛋白質(zhì)，20種以上的氨酰-tRNA合成酶，10多種起始因子、延伸因子和終止因子，約50種tRNA，各種rRNA、mRNA，100種以上翻譯后加工酶參與蛋白質(zhì)合成和加工。翻譯過程：翻譯的起始：核糖體與mRNA結(jié)合并與氨酰-tRNA生成起始復(fù)合物。肽鏈的延伸：核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，開始了從氨基端向羧基端的多肽合成。肽鏈的終止與釋放：核糖體從mRNA上解離。在翻譯過程中：核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板。tRNA是模板與氨基酸之間的接合體。在合成的各個(gè)階段有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。4.1遺傳密碼——三聯(lián)子克里克1954年提出假說：一定存在有稱作“聯(lián)接物”的小分子RNA，它既能夠固定氨基酸，又能夠與核酸模板發(fā)生相互作用。該假說認(rèn)為存在20種“聯(lián)接物”RNA分子，一種RNA對(duì)應(yīng)一種氨基酸，同時(shí)存在20種酶可以把一種氨基酸專一性地結(jié)合到一種“聯(lián)接物”RNA上4.1.1三聯(lián)子密碼及其破譯構(gòu)想：以3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸，則可以有43=64種密碼，可以滿足編碼20種氨基酸的需要(1954年，G.Gamow)。證明(1961年，F(xiàn).Crick&S.Brenner)：在模板mRNA中插入或刪除一個(gè)堿基，會(huì)改變?cè)撁艽a子以后全部氨基酸序列。若同時(shí)對(duì)模板進(jìn)行插入和刪除試驗(yàn)，插入和刪除的堿基數(shù)一樣，后續(xù)密碼子序列就不會(huì)變化，翻譯得到的后續(xù)的蛋白質(zhì)序列就保持不變。如果同時(shí)刪去3個(gè)核苷酸，翻譯產(chǎn)生少一個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，序列不發(fā)生變化。三聯(lián)子的確認(rèn)：1移碼突變2煙草壞死病外殼蛋白亞基400aa/1200bCrick提出的遺傳密碼的特點(diǎn)：1三個(gè)堿基一組編碼一個(gè)氨基酸2密碼是不重疊的3堿基的序列是從固定起點(diǎn)解讀的4密碼是簡并的這意味著，只有20種有意義的密碼子……這種密碼子數(shù)目與氨基酸的數(shù)目之間的精確對(duì)應(yīng)關(guān)系看起來似乎太完美了，不可能是不對(duì)的！Crick認(rèn)為，如果每個(gè)三聯(lián)體都被在正確的“閱讀框架”中閱讀的話，那么它將編碼一種氨基酸；但是一旦閱讀框架被位移了一個(gè)堿基的話，那么所有的三聯(lián)體將失去它們的編碼意義。歷史是這樣的……破譯密碼：1以均聚物、隨機(jī)共聚物和特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成(1961年Nirenberg)UUUUUUUUUUUUUUUUUU->PhePhePhePhePhePheCCCCCCCCCCCCCCCCCC->ProProProProProProAAAAAAAAAAAAAAAAAA->LysLysLysLysLysLysA/C共聚核苷：CCCCCACACACCCAAACAAACAAAProProHisThrGlnThrAsnLys多聚二核苷酸polyUG:UGUGUGUGUGUGUGUGUG->CysValCysValCysVal多聚三核苷酸polyUUC:UUCUUCUUCUUCUUCUUC->PhePhePhePhePhePheUCUUCUUCUUCUUCUUCU->SerSerSerSerSerSerCUUCUUCUUCUUCUUCUU->LueLueLueLueLueLue2核糖體結(jié)合技術(shù)(1964年,Nirenberg)人工合成三核苷酸NNN核糖體AA-tRNA*硝酸纖維素膜過濾檢測(cè)放射性UAA→終止密碼子(Ochre赭石)UAG→終止密碼子(Amber琥珀)UGA→終止密碼子(Opal蛋白石)擴(kuò)展：密碼偏愛Codonusage

bias4.1.2遺傳密碼的性質(zhì)密碼的連續(xù)性。起始密碼子決定所有后續(xù)密碼子的位置。密碼間無間斷也沒有重疊。密碼的簡并性。由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為簡并（degeneracy），對(duì)應(yīng)于同一種氨基酸的幾個(gè)密碼子稱為同義密碼子（synonymouscodon）。一般說來，編碼某一氨基酸的密碼子越多，該氨基酸在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的頻率也越高。精氨酸是個(gè)例外，因?yàn)樵谡婧松镏蠧G雙聯(lián)子出現(xiàn)的頻率較低，所以盡管有6個(gè)同義密碼子，蛋白質(zhì)中精氨酸的出現(xiàn)頻率仍然不高。真核生物中5-mC主要出現(xiàn)在5’-CpG-3’序列中，5-mC脫氨后生成的胸腺嘧啶（T），不易被識(shí)別和矯正。因此，特定部位的5-mC脫氨基反應(yīng)，將在DNA分子中引入可遺傳的轉(zhuǎn)化（C→T）。密碼的普遍性與特殊性。密碼子表是具有普遍性的，適用于一切生物，但也有些特殊情況。密碼子通用編碼線粒體編碼哺乳動(dòng)物酵母菌果蠅植物UGA

終止碼色氨酸色氨酸色氨酸終止碼AUA

異亮氨酸甲硫氨酸

甲硫氨酸

甲硫氨酸

異亮氨酸CUA

亮氨酸亮氨酸蘇氨酸

亮氨酸亮氨酸AGA

精氨酸終止碼

精氨酸絲氨酸

精氨酸密碼子與反密碼子的相互作用。在密碼子與反密碼子的配對(duì)中，前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則，第三對(duì)堿基有一定的自由度，可以"擺動(dòng)"，因而使某些tRNA可以識(shí)別1個(gè)以上的密碼子。如果有幾個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不同的密碼子都對(duì)應(yīng)于各自獨(dú)立的tRNA。第一、二位堿基相同的密碼子，則共用一種tRNA。原核生物中大約有30-50中tRNA，真核生物中可能存在50種tRNA。tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位。tRNA不僅為每個(gè)三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無誤地將所需氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供運(yùn)送載體，它又被稱為第二遺傳密碼。特點(diǎn)：存在經(jīng)過特殊修飾的堿基，3’端都以CCA-OH結(jié)束，這是其氨基酸結(jié)合位點(diǎn)。4.2tRNAtRNA的產(chǎn)生4.2.1tRNA的三葉草形二級(jí)結(jié)構(gòu)由于小片段堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成三葉草形的二級(jí)結(jié)構(gòu)。三葉草形tRNA分子上有4條根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)或已知功能命名的手臂：

受體臂：3’端有未配對(duì)的3～4個(gè)堿基；3’端的CCA，最后一個(gè)堿基2’和3’烴基可被氨酰化。

TψC臂：其中ψ[psai]表示假尿嘧啶。

反密碼子臂：位于套索中央有三聯(lián)反密碼子。

D臂：含有二氫尿嘧啶。各種tRNA均有74-95個(gè)核苷酸，其中有22個(gè)核苷酸是恒定不變的。

受體臂：鏈兩端堿基序列互補(bǔ)形成7bp的莖；3’端有未配對(duì)的3～4個(gè)堿基；3’端的CCA，最后一個(gè)堿基2’和3’烴基可被氨酰化。

TψC臂：常由5bp的莖和7nt的環(huán)組成。負(fù)責(zé)核糖體的識(shí)別。

反密碼子臂：常由5bp的莖和7nt的環(huán)組成。

D臂：含有二氫尿嘧啶。莖的長度常為4bp。

額外臂：4-21nt不等。tRNA上堿基的修飾tRNA的稀有堿基非常豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少有2個(gè)稀有堿基，最多有19個(gè)。多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是在反密碼子3'端鄰近部位出現(xiàn)的頻率最高。4.2.2tRNA的L形三級(jí)結(jié)構(gòu)酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的三級(jí)氫鍵?tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由在二級(jí)結(jié)構(gòu)中未配對(duì)堿基間形成的9個(gè)氫鍵（三級(jí)氫鍵）而引發(fā)的。?大部分恒定或半恒定核苷酸都參與三級(jí)氫鍵的形成。

tRNA高級(jí)結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)是研究其生物學(xué)功能的重要線索：tRNA上所運(yùn)載的氨基酸必須靠近位于核糖體大亞基上的多肽合成位點(diǎn)，而反密碼子必須與小亞基上的mRNA相配對(duì)，所以分子中兩個(gè)不同的功能基團(tuán)是最大限度分離的。這個(gè)結(jié)構(gòu)形式滿足了蛋白質(zhì)合成過程中對(duì)tRNA的各種要求而成為tRNA的通式，研究證實(shí)tRNA的性質(zhì)是由反密碼子而不是它所攜帶的氨基酸所決定的。tRNA的性質(zhì)是由反密碼子而不是它所攜帶的氨基酸所決定的：試驗(yàn)：14C-Cys-tRNAcys---Ni--->14C-Ala-tRNAcys4.2.3tRNA的功能翻譯階段遺傳信息從mRNA轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單個(gè)氨基酸的三聯(lián)密碼子形式存在的，這里起作用的是tRNA的解碼機(jī)制。氨基酸在合成蛋白質(zhì)之前先通過AA-tRNA合成酶活化，在消耗ATP的情況下結(jié)合到tRNA上，生成有蛋白質(zhì)合成活性的AA-tRNA，由AA-tRNA上的反密碼子與mRNA上的密碼子相互識(shí)別并配對(duì)，將AA帶到mRNA-核糖體復(fù)合物上，插入到正在合成的多肽鏈的適當(dāng)位置上。所有的tRNA都能夠與核糖體的A位點(diǎn)和P位點(diǎn)結(jié)合。A:氨酰-tRNA結(jié)合位點(diǎn)P:肽酰-tRNA結(jié)合位點(diǎn)起始tRNA延伸tRNA原核IF-2EF-Tu真核eIF-2eEF1tRNA能被翻譯輔助因子識(shí)別tRNA與其他因子的作用4.2.4tRNA的種類起始tRNA和延伸tRNA。一類能特異地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA（原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸）。其他tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。同工tRNA。幾個(gè)代表相同氨基酸的tRNA稱為同工tRNA（cognatetRNA）。在一個(gè)同工tRNA組內(nèi)，所有的tRNA均專一于相同的氨酰-tRNA合成酶。校正tRNA。分兩類：無義突變（nonsensemutation）的校正tRNA和錯(cuò)義突變（missensemutation）的校正tRNA。均通過改變其反密碼子區(qū)校正突變而依然合成原氨基酸。起始tRNA與延伸tRNA的區(qū)別起始tRNA和延伸tRNA無義突變和錯(cuò)義突變的校正校正tRNA（Sup=Suppressor抑制體）4.2.5氨酰-tRNA合成酶第一步：AA+ATP+酶(E)→E-AA-AMP+PPi第二步：E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP無論氨?；_始被連接到腺苷上的哪一個(gè)羥基上，最終都會(huì)連接到3'羥基上，因?yàn)?'-O-氨酰-tRNA會(huì)通過酯交換反應(yīng)（transesterification）轉(zhuǎn)移到3'羥基上。氨酰-tRNA合成酶能精確識(shí)別tRNA和氨基酸。大多數(shù)細(xì)胞可產(chǎn)生二十種不同的氨酰-tRNA合成酶，每一種酶負(fù)責(zé)一種氨基酸。它們各不相同，各負(fù)其責(zé)，使一種氨基酸與其相應(yīng)的一套tRNA分子結(jié)合。異亮氨酸-tRNA合成酶對(duì)異亮氨酸的親和力比對(duì)纈氨酸大225倍，體內(nèi)纈氨酸的濃度比異亮氨酸高5倍，纈氨酸被錯(cuò)誤滲入到異亮氨酸位點(diǎn)上去的機(jī)率應(yīng)是1/40，但實(shí)際誤差率只有約1/10000。研究發(fā)現(xiàn)，被錯(cuò)誤活化的纈氨酸不會(huì)被結(jié)合到tRNAIle上，而是被異亮氨酰-tRNA合成酶本身水解，即活化階段產(chǎn)生的誤差在后一階段被再次校正了。氨酰-tRNA合成酶與tRNA的識(shí)別ClassIbindsminorgrooveofacceptorarmClassIIbindsmajorgrooveofacceptorarm4.3核糖體生物細(xì)胞內(nèi)，核糖體像一個(gè)能沿mRNA模板移動(dòng)的工廠，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。核糖體是由幾十種蛋白質(zhì)和幾種核糖體RNA(ribosomalRNA,rRNA)組成的亞細(xì)胞顆粒。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有20000個(gè)核糖體，而真核細(xì)胞內(nèi)可達(dá)106個(gè)。核糖體蛋白占原核細(xì)胞總蛋白量的10%，占細(xì)胞內(nèi)總RNA量的80%。核糖體及其他組分在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的分布組分占細(xì)胞總量細(xì)胞內(nèi)數(shù)量細(xì)胞壁10%1細(xì)胞膜10%2DNA2%1mRNA2%3.5×103tRNA3%1.6×105rRNA21%8×105核糖體蛋白9%2×104可溶性蛋白40%106小分子3%7.5×106大腸桿菌核糖體基本成分

核糖體小亞基大亞基沉降系數(shù)70S30S50S總體相對(duì)分子質(zhì)量2.52×1069.30×1051.59×106主要rRNA（堿基數(shù)）

16S（1541）23S（2004）主要rRNA（堿基數(shù)）

5S（120）RNA相對(duì)分子質(zhì)量1.66×1065.60×1051.10×106RNA所占比例66%60%70%蛋白質(zhì)數(shù)量

2136蛋白質(zhì)相對(duì)分子量8.57×1053.70×1054.87×105蛋白質(zhì)所占比例34%40%30%在真核生物中，正在進(jìn)行蛋白翻譯的核糖體都不是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自由漂浮，而是直接或間接與細(xì)胞骨架或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)。細(xì)菌核糖體大都通過與mRNA的相互作用，被固定在核基因組上。4.3.1核糖體的結(jié)構(gòu)1核糖體由大小兩個(gè)亞基組成真核：RNA-3/5蛋白質(zhì)-2/5原核：RNA-2/3蛋白質(zhì)-1/3核糖體是一個(gè)致密的核糖核蛋白顆粒，可以解離為大小兩個(gè)亞基，大亞基約為小亞基相對(duì)分子質(zhì)量的二倍。每個(gè)亞基都含有一個(gè)分子質(zhì)量較大的rRNA和許多蛋白質(zhì)分子。這些大分子rRNA能在特定位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而完成核糖體不同亞基的組裝。原核生物、真核生物細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器的核糖體存在著很大差異……核糖體來源大亞基小亞基沉降系數(shù)RNA沉降系數(shù)RNA80S脊椎動(dòng)物60S20～29S40S18S5S5.8S80S無脊椎動(dòng)物植物60S25S40S16～18S5S5.8S70S原核生物50S23S30S16S5S55S脊椎動(dòng)物線粒體40S16～17S30S10～13S2核糖體蛋白（ribosomalprotein,r-蛋白）核糖體蛋白的催化活性依賴于核糖體整體。大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質(zhì)組成，分別用S1……S21表示，大亞基由36種蛋白質(zhì)組成，分別用L1……L36表示。真核生物細(xì)胞核糖體蛋白質(zhì)中，大亞基含有49種蛋白質(zhì)，小亞基有33種蛋白質(zhì)。Recently,wedemonstratedthatRPL5andRPL11actinamutuallydependentmannertoinhibitHdm2andstabilizep53followingimpairedribosomebiogenesis.GiventhatRPL5andRPL11formapreribosomalcomplexwithnoncoding5SribosomalRNA(rRNA)andthethreehavebeenimplicatedinthep53response,wereasonedtheymaybepartofanHdm2-inhibitorycomplex.Here,weshowthatsmallinterferingRNAsdirectedagainst5SrRNAhavenoeffectontotalornascentlevelsofthenoncodingrRNA,thoughtheypreventthereportedHdm4inhibitionofp53.Toachieveefficientinhibitionof5SrRNAsynthesis,wetargetedTFIIIA,aspecificRNApolymeraseIIIcofactor,which,likedepletionofeitherRPL5orRPL11,didnotinducep53.Instead,5SrRNAactsinadependentmannerwithRPL5andRPL11toinhibitHdm2andstabilizep53.Moreover,depletionofanyoneofthethreecomponentsabolishedthebindingoftheothertwotoHdm2,explainingtheircommondependence.Finally,wedemonstratethattheRPL5/RPL11/5SrRNApreribosomalcomplexisredirectedfromassemblyintonascent60SribosomestoHdm2inhibitionasaconsequenceofimpairedribosomebiogenesis.Thus,theactivationoftheHdm2-inhibitorycomplexisnotapassivebutaregulatedevent,whosepotentialroleintumorsuppressionhasbeenrecentlynoted.CellReportsVolume4,Issue1,p87–98,11July2013有些核糖體蛋白還具有重要的調(diào)控功能3核糖體RNA

（rRNA）真核生物rRNA剪切和核糖體的組裝原核rRNA前體加工示意原核生物真核生物5SrRNA：一個(gè)保守序列與tRNA（

TψC）作用；另一個(gè)保守序列與23SrRNA互補(bǔ)。5SrRNA：與原核5SrRNA結(jié)構(gòu)相似。5.8SrRNA：有與原核5SrRNA相同的保守序列，可能識(shí)別tRNA。23SrRNA：有一段與tRNAMet互補(bǔ)的序列；有一段序列與5SrRNA互補(bǔ)。28SrRNA：功能不明。16SrRNA：識(shí)別SD序列；3’端有與23SrRNA互補(bǔ)的序列。18SrRNA：3’端與原核16SrRNA同源。在高倍電鏡下得到的原核生物70S核糖體大、小亞基相結(jié)合的模型，核糖體分子可容納兩個(gè)tRNA和約40nt長的mRNA。

Howthesmall(30S)subunitof

E.coli

ribosomesisassembledfromthelarge16SribosomalRNA(rRNA)andandtwenty-oneindividualproteins./College/BIO/professors/culvera,'Top'viewofthe70SribosomewithmRNAandA-P-andE-sitetRNAs.b,c,Explodedviewofthe30Ssubunit(b)and50Ssubunit(c).ThestructureoftheL7/L12arm10wasfitontothe70Sribosome,withmRNAelongatedbymodelling.TMSchmeing&VRamakrishnan

Nature

461,1234-1242(29October2009)Structureoftheribosome.4核糖體有3個(gè)tRNA結(jié)合位點(diǎn)A位點(diǎn)（aminoacylsite）P位點(diǎn)（peptidylsite）E位點(diǎn)（exitsite）4.3.2核糖體的功能核糖體存在于每個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成。盡管在不同生物體內(nèi)其大小有別，但組織結(jié)構(gòu)基本相同，而且執(zhí)行的功能完全相同。核糖體包括多個(gè)活性中心，即：mRNA結(jié)合部位接受AA-tRNA部位(A位)結(jié)合肽基-tRNA的部位(P位)肽基轉(zhuǎn)移部位及形成肽鍵的部位(轉(zhuǎn)肽酶中心)此外，還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)。大小亞基功能：核糖體小亞基負(fù)責(zé)對(duì)模板mRNA進(jìn)行序列特異性識(shí)別，如起始部分的識(shí)別、密碼子與反密碼子的相互作用等，mRNA的結(jié)合位點(diǎn)也在小亞基上。大亞基負(fù)責(zé)攜帶AA-tRNA、肽鍵的形成、AA-tRNA與肽鏈的結(jié)合、A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶中心等在大亞基上。4.4蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制GTP4.4.1氨基酸的活化至少存在20種氨酰-tRNA合成酶，同一種氨酰-tRNA合成酶具有把同種氨基酸加到幾種同工tRNA上的能力。N-甲酰甲硫氨酰-tRNAfMet的形成：N-甲酰四氫葉酸+甲硫氨酰-tRNAfMet->四氫葉酸+N-甲酰甲硫氨酰-tRNAfMet20種氨基酸結(jié)構(gòu)圖4.4.2翻譯的起始蛋白質(zhì)合成的起始是指在模板mRNA編碼區(qū)5’端形成核糖體-mRNA-起始tRNA復(fù)合物并將（甲酰）甲硫氨酸放入核糖體P位點(diǎn)。原核生物中，30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合生成70S·mRNA·fMet-tRNAfMet起始復(fù)合物。真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始復(fù)合物。1原核生物翻譯的起始細(xì)菌中翻譯的起始需要如下7種成分:30S小亞基，模板mRNA，fMet-tRNAfMet，3個(gè)翻譯起始因子（IF-l、IF-2和IF-3），GTP，50S大亞基，Mg2＋。IF-3協(xié)助識(shí)別SD序列（Shine-Dalgarnosequence）起始tRNA與延伸tRNA的區(qū)別2真核生物翻譯的起始與原核生物比較：核糖體較大有較多的起始因子mRNA具有5’端帽子結(jié)構(gòu)Met-tRNAMet不甲酰化mRNA分子5’端的“帽子”和3’端的多聚A都參與形成翻譯起始復(fù)合物真核生物翻譯起始示意圖擴(kuò)展：Internalribosomeentrysite內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)Aninternalribosomeentrysite,abbreviatedIRES,isanucleotidesequencethatallowsfortranslationinitiationinthemiddleofamessengerRNA(mRNA)sequenceaspartofthegreaterprocessofproteinsynthesis.Usually,ineukaryotes,translationcanbeinitiatedonlyatthe5'endofthemRNAmolecule,since5'caprecognitionisrequiredfortheassemblyoftheinitiationcomplex.InternalRibosomeEntrySite(IRES)

are

RNA

structuresthatallowcapindependentinitiationoftranslation,andareabletoinitiatetranslationinthemiddleofamessenger

RNA.CripavirusIRES

alsoallowthetranslationinitiationonaAlanineorGlutaminetRNA.

DownstreamHairpinLoop(DLP)are

RNA

structuresthatallowinitiationofcapdependenttranslationintheabsenceofeIF2initiationfactor,wheretheinitiatingmethioninetRNAisplacedbythe

DLP

structureontheribosome./all_by_species/867.htmlIRES應(yīng)用4.4.3肽鏈的延伸肽鏈的延伸由肽基轉(zhuǎn)移酶催化（Peptidyltransferaseactivityresidesexclusivelyinthe23SrRNA.）NascentpolypeptideistransferredtoaminoacyltRNA.原核EF-TuEF-TsEF-G真核EF-1EF-24.4.4肽鏈的終止I類釋放因子：識(shí)別終止密碼子，并能催化新合成的肽鏈從P位點(diǎn)的tRNA中水解釋放出來。II類釋放因子：在多肽鏈釋放之后，刺激I類釋放因子從核糖體中解離出來。原核生物真核生物I類II類I類II類RF1(UAA、UAG)RF2(UAA、UGA)RF3eRF1eRF3大腸桿菌核糖體上蛋白質(zhì)合成的終止過程小結(jié)Functionalhomologiesofprokaryoticandeukaryotictranslationfactors.翻譯的產(chǎn)物4.4.5蛋白質(zhì)前體的加工新生多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必須經(jīng)過加工修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。N端fMet或Met的切除二硫鍵的形成特定氨基酸的修飾。氨基酸側(cè)鏈的修飾包括：磷酸化（如核糖體蛋白質(zhì)）、糖基化（如各種糖蛋白）、甲基化（如組蛋白、肌肉蛋白質(zhì)）、乙基化（如組蛋白）、羥基化（如膠原蛋白）和羧基化等。切除新生鏈中非功能片段1N端fMet或Met的切除不管是原核生物還是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽鏈合成完畢之前就被切除。(a)Inbacteria,theribosome-associatedpeptidedeformylase(PDF)removestheformylgroupoftheN-terminalformylmethionineofnascentproteins.Thisprocessisaprerequisitefortheproteolyticremovaloftheunmaskedmethioninebymethionineaminopeptidase(MAP).TheenlargementshowsPDF(cyanribbon)boundtoribosomalproteinL22(magenta)nexttotheribosomaltunnelexit(whitestar).ThesecondinteractionsiteofPDFontheribosome,proteinL32,isnotvisibleinthisviewoftheribosome,whichisslicedalongthetunnel.Thepathofthenascentchainisindicatedbyyellowspheres.(b)Ineukaryotes,theN-terminalmethionineofnascentpolypeptidesisoftenremovedbymethionineaminopeptidase.Irrespectiveofwhetherthisenzymaticprocessingoccurs,ribosome-associatedN-acetyltransferasescantransferanacetylmoietytotheN-terminalaminegroupofthenascentpolypeptide.NatureStructural&MolecularBiology16,589-597(2009)前體蛋白的切割：HIVProteinSplicingIsAutocatalyticAnintein(內(nèi)含肽)hastheabilitytocatalyzeitsownremovalfromaproteininsuchawaythattheflankingexteins(外顯肽)areconnected.Proteinsplicingiscatalyzedbytheintein.Mostinteinshavetwoindependentactivities:proteinsplicingandahomingendonuclease.Inproteinsplicingtheexteinsareconnectedbyremovingtheinteinfromtheprotein擴(kuò)展Proteinsplicingusestransesterifications內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)純化中的應(yīng)用2二硫鍵的形成細(xì)胞內(nèi)的還原性環(huán)境妨礙二硫鍵的形成。細(xì)菌二硫鍵在周質(zhì)空間，真核生物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中形成二硫鍵。3特定氨基酸的修飾磷酸化（如核糖體蛋白質(zhì)）糖基化（如各種糖蛋白）甲基化（如組蛋白、肌肉蛋白質(zhì)）乙基化（如組蛋白）羥基化（如膠原蛋白）羧基化糖基化是真核生物蛋白質(zhì)的特征之一N-linkedglycosylationsites(NXT/NXS)磷酸化由蛋白激酶催化，發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等三種氨基酸的側(cè)鏈。proteinkinaseA

甲基化包括發(fā)生在Arg、His、Gln側(cè)基的N-甲基化以及Glu和Asp側(cè)基的O-甲基化。Sitesofpost-translationalmodificationsonthehistonetails.Themodificationsshownincludeacetylation(purple),methylation(red),phosphorylation(green),andubiquitination(orange).——Genes&Dev.

2001.

15:2343-2360

cross-linkedprotein(蛋白質(zhì)交聯(lián))Traffic.201213:19-24左：催化谷氨酰胺與賴氨酸發(fā)生交聯(lián)的酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase）右：泛素76位甘氨酸與底物蛋白質(zhì)的化學(xué)鍵，催化的酶為E1、E2和E3。擴(kuò)展4切除新生鏈中非功能片段前胰島素原的加工4.4.6蛋白質(zhì)的折疊新生多肽鏈必須經(jīng)過正確的折疊，才能形成動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定的三維構(gòu)象，從而表現(xiàn)出生物學(xué)活性或功能。多肽鏈的折疊式一個(gè)復(fù)雜的過程，新生肽鏈一般首先折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)，再進(jìn)一步折疊盤繞成三級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)于寡聚蛋白質(zhì)，一般還需要組裝成更為復(fù)雜的四級(jí)結(jié)構(gòu)。分子伴侶（molecularchaperone）是能在細(xì)胞內(nèi)輔助新生肽鏈正確折疊的一類蛋白質(zhì)。它是一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的保守性蛋白質(zhì)。分為兩類：熱休克蛋白（heatshockprotein）、伴侶素（chaperonin）。1.熱休克蛋白是一類應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，包括HSP70、HSP40和GrpE三個(gè)家族，廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中。2.伴侶素包括HSP60和HSP10（原核中分別為GroEL和GroES），它主要是為非自發(fā)性折疊蛋白提供能折疊形成天然結(jié)構(gòu)的微環(huán)境。4.4.7蛋白質(zhì)合成的抑制劑主要是抗生素、干擾素、核糖體滅活蛋白等?？咕貙?duì)蛋白質(zhì)合成的作用：阻止mRNA與核糖體結(jié)合（氯霉素）；阻止AA-tRNA與核糖體結(jié)合（四環(huán)素類）；干擾AA-tRNA與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生錯(cuò)讀（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）；作為競爭性抑制劑抑制蛋白質(zhì)合成。如鏈霉素能干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，也會(huì)導(dǎo)致mRNA的錯(cuò)讀。干擾素處理細(xì)胞后引起翻譯起始抑制和mRNA降解抗生素在蛋白質(zhì)合成不同階段的抑制作用4.5蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制翻譯-轉(zhuǎn)運(yùn)同步機(jī)制蛋白質(zhì)的合成和運(yùn)轉(zhuǎn)同時(shí)發(fā)生。分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機(jī)制運(yùn)輸?shù)?。翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運(yùn)轉(zhuǎn)。在細(xì)胞器發(fā)育過程中，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)摹?.5.1翻譯-轉(zhuǎn)運(yùn)同步機(jī)制機(jī)制過程：

分泌蛋白的生物合成開始于核糖體，翻譯到大約50個(gè)氨基酸殘基，信號(hào)肽開始從核糖體的大亞基露出，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體識(shí)別并與之結(jié)合。

信號(hào)肽過膜后被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的信號(hào)肽酶水解，新生肽隨之通過蛋白孔道穿越疏水的雙層磷脂。

當(dāng)核糖體移到mRNA的“終止”密碼子，蛋白質(zhì)合成即告完成，翻譯體系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖體重新處于自由狀態(tài)。

蛋白質(zhì)定位的信息存在于該蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)中，并且通過與膜上特殊受體的相互作用得以表達(dá)。信號(hào)肽緊接在起始密碼之后，大部分是疏水氨基酸。信號(hào)肽的長度在13～36個(gè)殘基。

信號(hào)肽的特點(diǎn)： 10～15個(gè)疏水氨基酸； N端有帶正電荷的氨基酸； C端接近切割點(diǎn)處代數(shù)個(gè)極性氨基酸；離切割點(diǎn)最近的氨基酸往往帶有很短的側(cè)鏈（Ala,Gly）。蛋白合成-定位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1.完整的信號(hào)肽是保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的必要條件。2.僅有信號(hào)肽還不足以保證蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)生。3.信號(hào)序列的切除并不是轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的。4.并非所有的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都有可降解的信號(hào)肽。signalrecognition

particle

新生蛋白質(zhì)通過同步轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的主要過程4.5.2翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制葉綠體和線粒體中有許多蛋白質(zhì)和酶是由細(xì)胞質(zhì)提供的，其中絕大多數(shù)以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)。線粒體蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特征:通過線粒體膜的蛋白質(zhì)在運(yùn)轉(zhuǎn)之前大多數(shù)以前體形式存在，它由成熟蛋白質(zhì)和位于N端的一段前導(dǎo)肽（leaderpeptide）共同組成，前導(dǎo)肽約含20～80個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)前體蛋白過膜時(shí)，前導(dǎo)肽被多肽酶所水解，釋放成熟蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜的運(yùn)轉(zhuǎn)是一種需要能量的過程。蛋白質(zhì)通過線粒體膜運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，首先由外膜上的Tom受體復(fù)合蛋白識(shí)別與分子伴侶相結(jié)合的待運(yùn)轉(zhuǎn)多肽，通過Tom和Tim組成的膜通道進(jìn)入線粒體內(nèi)腔。蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的能量來自線粒體Hsp70引發(fā)的ATP水解和膜電位差。Tom：TransporterOuterMembrane

Tim：TransporterInnerMembrane

前導(dǎo)肽的作用與性質(zhì)擁有前導(dǎo)肽的線粒體蛋白質(zhì)前體能夠跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)入線粒體，在這一過程中前導(dǎo)肽被水解，前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍?，則失去繼續(xù)跨膜能力。因此，前導(dǎo)肽對(duì)線粒體蛋白質(zhì)的識(shí)別和跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)起著關(guān)鍵作用。前導(dǎo)肽具有如下特性：帶正電荷的堿性氨基酸（特別是精氨酸）含量較為豐富，它們分散于不帶電荷的氨基酸序列之間；缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；羥基氨基酸（特別是絲氨酸）含量較高；有形成兩親（既有親水又有疏水部分）а-螺旋結(jié)構(gòu)的能力。葉綠體蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)葉綠體多肽在胞質(zhì)中的游離核糖體上合成后脫離核糖體并折疊成具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，多肽上某些特定位點(diǎn)結(jié)合于只有葉綠體膜上才有的特異受體位點(diǎn)。葉綠體定位信號(hào)肽一般有兩個(gè)部分，第一部分決定該蛋白質(zhì)能否進(jìn)入葉綠體基質(zhì)，第二部分決定該蛋白能否進(jìn)入類囊體。葉綠體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有如下特點(diǎn)：活性蛋白水解酶位于葉綠體基質(zhì)內(nèi)。葉綠體膜能夠特異地與葉綠體蛋白的前體結(jié)合。葉綠體前體內(nèi)可降解序列因植物和蛋白質(zhì)種類不同而表現(xiàn)出明顯的差異。4.5.3核定位蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為了核蛋白的重復(fù)定位，這些蛋白質(zhì)中的信號(hào)肽——被稱為核定位序列（NLS—NuclearLocalizationSequence）一般都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。AlignmentofNipahmatrixsequencewithknownNLSs.

PLoSPathog20106(11):e1001186HHV-6AIE2423-440and1207-1215domainsactasfunctionalnuclearlocalizationsignals.Verocellsweregrownonmicroscopyslides,transfectedwithGFP-IE2

423-440,GFP-IE21207-1215orcontrolGFPconstruct,andprocessedforimmunofluorescenceasdescribedundermaterialsandmethods.LeftpanelsrepresentGFPdistribution(GFP),whilesecondcolumnpanelsshowthesamefieldscoloredwithDAPInuclearstain(DAPI).Localizationofthefusionproteinsversusnucleusisunderscoredinthemergepanels.Totalmagnification:400×http://theses.ulaval.ca/archimede/fichiers/24149/ch04.html蛋白質(zhì)向核內(nèi)運(yùn)輸過程需要核運(yùn)轉(zhuǎn)因子（Importin）α、β和一個(gè)低分子量GTP酶（Ran）參與。核定位蛋白跨細(xì)胞核膜運(yùn)轉(zhuǎn)過程示意圖：核孔細(xì)菌中蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)4.6蛋白質(zhì)的修飾、降解和穩(wěn)定性研究大腸桿菌蛋白的降解需要一個(gè)依賴于ATP的蛋白酶（稱為Lon）。真核生物蛋白降解可能主要依賴于泛素（ubiquitin）。蛋白質(zhì)的半衰期大約從30s到許多天不等。像血紅蛋白這樣少數(shù)蛋白的半衰期與細(xì)胞周期同樣長。4.6.1

泛素化修飾介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解真核生物蛋白降解可能主要依賴于泛蛋白（ubiquitin）。泛素是76個(gè)氨基酸的小蛋白，序列高度保守。泛素泛素修飾的化學(xué)鍵泛蛋白與被降解蛋白連接示意圖E1（活化酶）,E2（結(jié)合酶）,E3（連接酶）UbiquitinProteasomePathway泛素-蛋白酶體途徑是一種較普遍的內(nèi)源蛋白質(zhì)降解方式。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，并非所有泛素化修飾都會(huì)導(dǎo)致蛋白降解。有些泛素化