出口凍兔肉中出血病病毒檢驗 免疫學(xué)方法

出口凍兔肉中兔出血病病毒檢驗免疫學(xué)方法4.2.11三氯甲烷(分析純)。4.2.13氯化鉀(分析純)。4.2.16卵清蛋白(OVA)。4.2.191%人血紅細胞懸液，見附錄A.1。4.2.202%經(jīng)致敏的雙醛化綿羊紅細胞懸液，見附錄A.2。4.2.21包被液(CB),見附錄A.3。4.2.23洗滌液(PBST),見附錄A按GB/T18088的規(guī)定采樣。35.2抽樣方法以同一檢驗檢疫批為單位抽樣，按規(guī)定的抽樣件數(shù)，根據(jù)樣點分布均勻化的原則，按棋盤式或?qū)蔷€隨機抽取。抽取的樣品需在實驗室進行如下處理；a)凍帶骨兔肉：每只被采集樣品的免體取脛骨兩支，裝入清潔的塑料袋中；b)去骨兔肉：每件中剪取同一免體肌肉20g~30g,作為原始樣品，混合后置于清潔容器內(nèi)，作為混合原始樣。混合原始樣的質(zhì)量不少于300g。5.3樣品的標(biāo)識和保存取代表性樣品應(yīng)保持冷凍狀態(tài).保證樣品不受外界的污染，加貼標(biāo)簽和官方封識。樣品應(yīng)立即送到實驗室進行檢測，存查樣品應(yīng)存放在-18℃的溫度下保存，保存期至索賠期滿為止。6操作步服6.1試樣的制備6.1.1.1骨髓試樣以持針器夾碎脛骨取出骨髓。裝入小型塑料離心管，稱量。用5倍量的0.01mol/1.pH7.4PBS稀釋。用玻璃研磨器研磨勻漿后裝入玻璃瓶內(nèi)。6.1.1.2肌肉試樣稱量10g肌肉，加入50mL.0.01mol/LpH7.4三角燒瓶。PBS。高速勻漿機勻漿1min~3min,勻案后裝入勻漿后試樣置低溫冰箱內(nèi)反復(fù)凍融三次后，3500r/min離心5min取上清液。在所得上清液中，加入上清液量6%的聚乙二醇-6000,并加氯化的至3%,置4℃冰箱過夜。濃縮過的樣品液3500r/min～4000r/min離心10min去上清液，沉淀物以少量0.01mol/l.pH7.4PBS懸浮，成混懸液(肌肉樣用1mL,骨髓樣用0.3mL)。在所得混懸液中加入四分之一體積的三氯甲烷，搖勻4000r/min離心10min取水相，置冰箱凍結(jié)保存?zhèn)溆谩?.2.1血凝試驗(HA試驗)6.2.1.1在96孔V型微量血凝反應(yīng)板上，從第一孔至第十一孔，每孔加入PBS25pl.。然后在第一孔加入待檢樣品的濃縮液25μL.,從第一孔開始用移液器，作等量稀釋至第十孔，最后一孔棄去25μl。第十一孔是PBS對照，第十二孔加入1110正常兔肝懸液25μL對照。6.2.1.2每孔各加入1%人“O”型虹細胞25μL…,立即在微型混合器上搖勻，置室溫。待對照孔血組胞完全沉積后觀察結(jié)果。6.2.1.3血凝效價表示方法，其中血凝程度以++++、+++、++、+、一表示：a)“++++”;紅組胞均勻鋪于孔底；b)“+++”t紅細胞基本同上，但邊境不整齊，有下垂趨向：c)“++”:紅細胞于孔底形成一個環(huán)狀，四周有小凝結(jié)塊；d)“+”;紅細胞于管底形成一個小團，但邊緣不光滑，四周有凝結(jié)塊；e)“-”;紅細胞于孔底形成小團，邊緣整齊，光滑。注：出現(xiàn)++++為其凝集終點。6.2.2血凝抑制試驗(HI試驗)6.2.2.1在96孔V型微量血凝反應(yīng)板上，待檢樣品浪縮液稀釋方法同上。一個樣品做相同的兩排。6.2.2.2第一排每孔加PBS25pL,第二排每孔加陽性血清25pL搖勻，37℃溫箱放置10min。6.2.2.3各孔加入1%人“O”型紅細胞25pl.,立即在微型混勻器上搖勻，置室溫。待對照孔紅細胞完全沉淀后觀察結(jié)果。6.2.2.4結(jié)果判定中，血凝效價表示方法同6.2.1.3。HA與HI試驗兩排孔的血凝效價相差兩個滴度以上者則為陽性。6.3.1間接血凝試驗(IHA試驗)6.3.1.1反應(yīng)在96孔V型微量血凝反應(yīng)板上進行。根據(jù)被檢材料的份數(shù)，按每份材料一排孔安排，在反應(yīng)板上依順序編號。6.3.1.2于計劃各排的每孔中加PBS稀釋液25pl.。6.3.1.3取被檢材料25pL,對號加入該排第一孔，逐孔向后做倍比稀釋至倒數(shù)第二孔為止，最后一孔為稻釋液對照。6.3.1.4每板設(shè)已知陽性、陰性抗原對照各一排。6.3.1.5每孔加致敏血球25μL.移反應(yīng)板于混勻器上中速據(jù)探至紅細胞分散均勻(約1min),然后將反應(yīng)板置37℃溫箱，經(jīng)80min～90min后觀察結(jié)果。6.3.1.6IHA凝集效價表示方法：a)“++++”;紅細胞均勻鋪于孔底；b)“+++”;孔內(nèi)凝結(jié)團大于孔而積50%,未遍及全孔者：c)“++”:紅細胞少許沉積孔底，周圍有混濁帶約占孔面積50%;d)“+”;紅細胞大部分沉積孔底，沉淀邊緣模糊者；e)“—”;紅細胞于孔底形成小團，邊緣整齊，光滑。注：結(jié)果以”++++”為凝集終點。6.3.2間接血凝抑制試驗(IHI試驗)6.3.2.1每份樣品按兩排孔安排，操作同前，唯IHI孔增加稻釋液25pL,振蕩均勻后，將反應(yīng)板置37℃溫箱中經(jīng)80min~90min判定結(jié)果。6.3.2.2結(jié)果判定中，IHI與IHA試驗兩排孔的血凝價相差兩個滴度以上者為陽性。6.4.1將提純抗體用包被液作1:640稀釋后加入酶標(biāo)反應(yīng)板，每孔100pL。包被后置4℃冰箱過夜。6.4.2取出包被的反應(yīng)板用洗滌液洗三次.每次3min(每次加洗滌液后，放置3min再傾去).將板甩干拍凈。6.4.3用稀釋液將待檢濃縮液作142和1:4稀釋，每個檢樣的兩種稀釋液分別各加入兩個孔，每孔100pL,每塊板同時加陽性，陰性樣品各兩孔，作對照用，每塊板同時加兩孔稀釋液留作空白對照，置37℃溫箱90min。6.4.4取出反應(yīng)板用洗滌液洗三次，方法同6,4.2。6.4.5各孔加酵標(biāo)第二抗體100pL.,置37℃溫箱90min。6.4.6取出反應(yīng)板用洗滌液洗三次，每次3min,將板甩干拍凈。6.4.7每孔加底物液100gL置37℃溫箱15min。要求避光。6.4.8取出反應(yīng)板，每孔加終止液50pL.終止反應(yīng)。6.4.9測定光密度值或目測。6.4.10結(jié)果判定以酶標(biāo)測定僅測定OD值。若待檢樣品OD值與已知陰性樣品OD值之比(P/N)>2時，判定為陽性，否則為陰性。若目測，凡是待檢孔的顏色比陰性孔深者為陽性，否則為陰性。如果采用商品化試劑盒按試劑盒規(guī)定的方法檢測。7報告結(jié)果報告陽性結(jié)果。HA、HI試驗，IHA、IHI試驗及ELISA試驗。三者任選一種檢測方法進行檢測，凡出現(xiàn)陽性者均可報告陽性結(jié)果。否則判為陰性結(jié)果。8檢驗流程6(規(guī)范性附錄)A.11%人血紅細胞懸液新鮮人血紅細胞(O型)用20倍量生理鹽水洗滌三次，最后以2000r/min離心15min,吸取壓積組胞用生理鹽水配成1%懸液。稱取氯化鈉(NaCl)8.5g,氯化鉀(KCl)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO,·12H?O)2.9g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,定容至1000ml.雙蒸水中，保存于室溫或4℃冰箱中。A.32%經(jīng)致敏的雙醛化綿羊紅細胞懸液以1mL.雙醛化綿羊紅細胞的致敏為例。1ml.雙醛化綿羊紅細胞離心，去上清液，用pH7.4.0.01mol/LPBS洗一次，5000r/min離心10min.去上清液，加入4.9mL生理鹽水，0.1ml.1%鞣酸，37℃水浴10min,5000r/min離心10min,去上清液，加入pH4.3,0.2mol/L乙酸緩沖液5mL,RHDV-lgG0.05mL,37℃水浴30min。5000r/min離心10min,去上清液，用5mL生理鹽水洗三次，用pH7.4.0.01mol/L的PES配制成2%血球懸液備用。A.4包被液(CB,pH9.6,0.05mol/L.磷酸鹽緩沖液)碳酸鈉(Na,CO)1.59g、碳酸氫鈉(NaHCO?)2.93g加雙蒸水溶解至1000mL。A.5洗滌液(FBST,pH7.4磷酸鹽緩沖液-0.5%吐溫20)氯化的(NaCl)8.0g、磷酸氫二鈉(Na?HPO,·12H?O)2.9g、磷酸二氫押(NaHPO?)0.2g、氯化鉀(KCl)0.2g、吐溫-200.5mL.加雙蒸水溶解至1000mL。A.6稀釋液(保溫液PBST-OVA)于PBST內(nèi)加入卵清蛋白使其濃度為0,1%。A.7底物液A.7.160mgTMB(四甲基聯(lián)苯胺》溶于10mL.二甲亞砜中，4℃避光保存，備用(可保存3個月)。A.7.2140mg過氧化脲溶于100mL,pH5,6.1mol/L.的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液中，4℃避光保存，備用(可保存3個月)。A.7,3臨用前取按A.7,1要求所制溶液250pL,溶入到2mL.按A.7,2要求所制溶液中，隨即加入18ml.雙燕水混勻。A.BpH5.6.1mol/L.醋酸鈉-檸檬酸緩沖液500mL.1mol/L醋酸鈉加17mL1mol/L檸檬酸緩沖液。于500ml.雙蒸水中緩慢加入76mL.濃硫酸(98%),混勻。A.10兔出血病病毒陽性血清(RHDV)的制備取健康兔，肌肉注射本病毒疫苗1mL。然后分別在第15天，第3