基因表達(dá)的檢測(cè)的幾種方法

基因表達(dá)檢測(cè)的最終技術(shù)目標(biāo)是能確定所關(guān)注的任何組織、細(xì)胞的RNA的絕對(duì)表達(dá)量?？梢韵葟臉颖局谐樘酭NA，再標(biāo)記RNA，然后將這些標(biāo)記物作探針與芯片雜交，就可得出原始樣本中不同RNA的量。然而用于雜交的某個(gè)特定基因的RNA的量與在一個(gè)相應(yīng)雜交反應(yīng)中的信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系十分復(fù)雜，它取決于多種因素，包括標(biāo)記方法、雜交條件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于檢驗(yàn)兩個(gè)或多個(gè)樣本中的某種RNA的相對(duì)表達(dá)量。樣本之間某個(gè)基因表達(dá)的差異性（包括表達(dá)的時(shí)間、空間特性及受干擾時(shí)的改變）是基因表達(dá)最重要的，而了解RNA的絕對(duì)表達(dá)豐度只為進(jìn)一步的應(yīng)用或多或少地起一些作用。

基因表達(dá)的檢測(cè)有幾種方法。經(jīng)典的方法（仍然重要）是根據(jù)在細(xì)胞或生物體中所觀察到的生物化學(xué)或表型的變化來(lái)決定某一特定基因是否表達(dá)。隨著大分子分離技術(shù)的進(jìn)步使得特異的基因產(chǎn)物或蛋白分子的識(shí)別和分離成為可能。隨著重組DNA技術(shù)的運(yùn)用，現(xiàn)在有可能檢測(cè)．分析任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前有好幾種方法廣泛應(yīng)用于于研究特定RNA分子。這些方法包括原位雜交．NORTHERN凝膠分析．打點(diǎn)或印跡打點(diǎn)．S－1核酸酶分析和RNA酶保護(hù)研究。這里描述RT-PCR從RNA水平上檢查基因表達(dá)的應(yīng)用。8f3f-|2L)K)b7]-~-|

RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)的問(wèn)題討論

關(guān)于RT-PCR技術(shù)方法的描述參見PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展，在此主要討論它在應(yīng)用中的問(wèn)題。理論上1μL細(xì)胞質(zhì)總RNA對(duì)稀有mRNA擴(kuò)增是足夠了（每個(gè)細(xì)胞有1個(gè)或幾個(gè)拷貝）。1μL差不多相當(dāng)于50－100，000個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中所含RNA的數(shù)量，靶分子的數(shù)量通常大于50，000，因此擴(kuò)增是很容易的。該方法所能檢測(cè)的最低靶分子的數(shù)量可能與通常的DNAPCR相同；例如它能檢測(cè)出單個(gè)RNA分子。當(dāng)已知量的轉(zhuǎn)錄RNA（用T7RNA聚合酶體外合成）經(jīng)一系列稀釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)PCR的方法可檢測(cè)出10個(gè)分子或低于10個(gè)分子，這是反映其靈敏度的一個(gè)實(shí)例。用此技術(shù)現(xiàn)已從不到1個(gè)philadelphia染色體陽(yáng)性細(xì)胞株K562中檢測(cè)到了白血病特異的MRNA的轉(zhuǎn)錄子。因此沒(méi)必要分離polyA+RNA，RNA/PCR法有足夠的靈敏度來(lái)滿足絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件的需要。

7H+F&_*S6W(a8p:[,@-d,{

將PCR緩沖液同時(shí)用于反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)和PCR反應(yīng)，可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟。我們發(fā)現(xiàn)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程皆用PCR緩沖液的結(jié)果相當(dāng)于或優(yōu)于先用反轉(zhuǎn)錄緩沖液合成CDNA，然后PCR緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)。當(dāng)然，值得注意的是PCR緩沖液并不最適合第一條DNA鏈的合成。我們對(duì)不同的緩沖液用于大片段DNA合成是否成功還沒(méi)有進(jìn)行過(guò)嚴(yán)格的研究。

反轉(zhuǎn)錄酶的選擇似乎對(duì)實(shí)驗(yàn)方法成功與否并不十分重要?；騽?dòng)物的多個(gè)部位而不必為取樣而將它處死。我們還可以列舉許多這樣的例子，但我們留給讀者一些有關(guān)檢測(cè)方面的設(shè)想。

4^$ik2N2N,s(q

用于診斷的RNA序列的擴(kuò)增'n.u6Y&`!m:g(|/Z

"j#i'V7_.l"f.h,e.M

在許多情況下，一個(gè)特異性的RNA分子可作為感染或遺傳/癌疾病的診斷。在反轉(zhuǎn)錄病毒疾病領(lǐng)域中，檢測(cè)與具有侵染活性密切相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組或特異轉(zhuǎn)錄子是否存在是非常重要的?，F(xiàn)已對(duì)HIV-1病人，HTLV-1，2以及MoloneyMulV的細(xì)胞株進(jìn)行了研究。也可以用RNA/PCR比較容易地檢測(cè)出常見的感冒病毒即人鼻病毒。對(duì)RNA和DNA病毒的RNA轉(zhuǎn)錄子的分析有利于對(duì)病毒的潛伏期，復(fù)制期等生活周期進(jìn)行研究。)T0@%v7C5O7z'_!?

-l$W)p9{+p5w)}

在某些類型的癌細(xì)胞中有新的mRNA表達(dá)。如慢性骨髓性白血病(CML)．某些急性淋巴白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)，只在病人的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有嵌合的mRNA(BCR-ABL)。此嵌合mRNA是診斷此類疾病存在的良好依據(jù)。在許多腫瘤的治療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療具有抗性。DNA水平的擴(kuò)增并不一定導(dǎo)致表達(dá)的增加，但大量相應(yīng)的mRNA的存在則使表達(dá)增加。DNA水平的擴(kuò)增并不一定導(dǎo)致表達(dá)的增加，但大量相應(yīng)的cDNA的存在則使表達(dá)增加。用RNA/PCR方法來(lái)分析復(fù)合抗藥性(MDR)10基因和胸腺核苷酸合成酶(TS)基因，發(fā)現(xiàn)了這mRAN水平的增高.突變的RAS原癌基因的mRNA分析(見參考文獻(xiàn)25綜術(shù)述)在癌癥的診斷或預(yù)測(cè)方面具有診斷價(jià)值。mRNA分析比常規(guī)的DNA基因組分析有優(yōu)越之處。由于沒(méi)有內(nèi)含子序列干擾mRNA的擴(kuò)增，因此可以僅用一組引物就能夠擴(kuò)增H-，K-，和N-RAS三個(gè)mRNA序列(E.S.K，未發(fā)表)。這樣便可以比較容易地檢測(cè)出第12、13和61密碼的突變，這些突變被認(rèn)為是發(fā)生癌的原因。

癌癥誘因的檢測(cè)

3j.s)S/\'v'f;g

在下面將列舉數(shù)個(gè)RNA/PCR擴(kuò)增方法的主要應(yīng)用。首先是對(duì)鼠鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶mRNA進(jìn)行亞克隆來(lái)確定缺失點(diǎn)突變的位置。同樣，該方法可用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄后的剪接，研究與HLA疾病相關(guān)性因素，分析人HPRT突變，研究自身免疫與T細(xì)胞受體序列之間的關(guān)系，分析人堿性磷酸脂酶的突變，研究土撥鼠肝炎病毒引發(fā)的c-myc活性，確定刺桐丁蛋白4.1mRNA的剪接變異，等等。6p/l$I6~5W'E5^;U9a$\

根據(jù)已發(fā)表的序列合成擴(kuò)增mRNA的引物，我們發(fā)現(xiàn)用RNA/PCR是獲取cDNA的最簡(jiǎn)便的方法。用在5"末端帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物來(lái)擴(kuò)增mRNA的一部分或全部編碼區(qū)域。擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)合適的酶切并與適于表達(dá)的載體連接或制備成探針。按此方法可在一星期內(nèi)完成從RNA樣品到用于高效表達(dá)的修飾cDNA克隆.這比常規(guī)的合成/篩選cDNA庫(kù)，亞克隆靶cDNA，為達(dá)到表達(dá)目的而對(duì)克隆進(jìn)行誘變等過(guò)程要簡(jiǎn)單得多。區(qū)別主要在于用于擴(kuò)增和分離cDNA克隆的引物為簡(jiǎn)并引物。引物序列是根據(jù)氨基酸的序列而定的，因此當(dāng)只知道很少的蛋白質(zhì)序列時(shí)，就有可能擴(kuò)增特異的RNA分子。當(dāng)只知一個(gè)內(nèi)部