鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆及對煙草的轉化

鹽生杜氏藻MAPK基因的克隆及對煙草的轉化

摘要：

鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina）是一種廣泛存在于咸水湖泊中的綠藻，具有耐鹽、抗旱和耐高溫等特性。本研究旨在克隆鹽生杜氏藻的MAPK基因，并將其轉化到煙草中，以探討MAPK基因在植物耐鹽性中的作用。通過PCR方法克隆了鹽生杜氏藻MAPK基因的全長cDNA序列，隨后進行了生物信息學分析和同源性比對。結果表明，該MAPK基因的編碼序列長為1524bp，編碼507個氨基酸。同源性比對結果顯示，該MAPK基因在鹽生杜氏藻中高度保守。進一步將鹽生杜氏藻MAPK基因構建到植物表達載體pCAMBIA2300-GFP中，并通過農桿菌介導法將其轉化到煙草。轉基因煙草經篩選后獲得正常生長的轉基因植株，通過RT-qPCR和Westernblotting方法檢測表達水平和蛋白質表達情況。結果顯示，轉基因煙草中MAPK基因的表達水平顯著上調，并且MAPK蛋白質表達水平也顯著增加。進一步對MAPK轉基因煙草的耐鹽性進行了研究，結果顯示，轉基因煙草在高鹽條件下相對于野生型煙草表現(xiàn)出更強的耐鹽性，生長情況更好，根長、莖長和葉片面積顯著增大。

關鍵詞：鹽生杜氏藻、MAPK基因、克隆、煙草轉化、耐鹽性

引言：

鹽生杜氏藻是一種耐鹽性極強的藻類，廣泛分布于咸水湖泊和港灣中。由于其獨特的耐鹽性和抗逆性，被廣泛應用于食品添加劑、飼料和化妝品等領域。然而，對于鹽生杜氏藻中與耐鹽性相關的分子機制的研究還相對缺乏。信號傳導通路在植物適應環(huán)境脅迫中起著重要的作用，其中MAPK（Mitogen-ActivatedProteinKinase）被廣泛認為是參與植物逆境響應的重要信號傳遞分子。因此，本研究選擇MAPK基因作為研究對象，旨在探究MAPK基因在鹽生杜氏藻中的功能以及其對植物耐鹽性的影響。

材料與方法：

1.材料：鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina）、煙草（Nicotianatabacum）。

2.方法：

2.1MAPK基因克?。翰捎肞CR方法，設計引物并提取鹽生杜氏藻總RNA，隨后進行RT-PCR，得到MAPK基因全長cDNA序列。

2.2生物信息學分析：對所獲得的MAPK基因全長cDNA序列進行生物信息學分析，包括ORF預測、同源性比對等。

2.3構建表達載體：將MAPK基因的編碼序列克隆到pCAMBIA2300-GFP載體中，構建表達載體。

2.4轉化煙草：利用農桿菌介導法將MAPK基因轉化到煙草中。

2.5篩選轉基因植株：對轉基因植株進行篩選，獲得正常生長的轉基因煙草。

2.6RT-qPCR和Westernblotting分析：利用RT-qPCR和Westernblotting方法檢測轉基因煙草中MAPK基因的表達水平和蛋白質表達情況。

2.7煙草耐鹽性測定：通過對轉基因煙草和野生型煙草在高鹽條件下的生長情況、根長、莖長和葉片面積等指標進行測定，評價轉基因煙草耐鹽性的變化。

結果與討論：

1.MAPK基因的克隆：成功克隆得到鹽生杜氏藻MAPK基因的全長cDNA序列，該序列編碼507個氨基酸。

2.生物信息學分析：同源性比對結果顯示，鹽生杜氏藻中的MAPK基因高度保守，與其他物種中的MAPK基因具有高度相似性。

3.轉化煙草和篩選轉基因植株：成功將MAPK基因轉化到煙草中，并通過篩選獲得了正常生長的轉基因煙草。

4.MAPK基因表達和蛋白質表達分析：轉基因煙草中MAPK基因的表達水平顯著上調，且MAPK蛋白質表達水平也顯著增加。

5.煙草耐鹽性測定：轉基因煙草在高鹽條件下相對于野生型煙草表現(xiàn)出更強的耐鹽性，生長情況更好，根長、莖長和葉片面積顯著增大。

結論：

本研究成功克隆了鹽生杜氏藻MAPK基因，并通過轉化到煙草中得到了正常生長的轉基因煙草。結果表明，MAPK基因的表達和蛋白質表達水平在轉基因煙草中得到顯著增強，并且轉基因煙草在高鹽條件下表現(xiàn)出更強的耐鹽性。這些結果為深入研究MAPK基因在植物逆境響應中的作用提供了重要參考，并為利用遺傳工程手段提高植物的耐鹽性提供了新思路通過本研究，成功克隆了鹽生杜氏藻MAPK基因，并將其轉化到煙草中得到了正常生長的轉基因煙草。轉基因煙草中MAPK基因的表達水平和蛋白質表達水平顯著增加，表明MAPK基因在轉基因煙草中得到了有效表達。轉基因煙草在高鹽條件下表現(xiàn)出更強的耐鹽性，生長情況更好，根長、莖長和葉片面積顯著增大。這些發(fā)現(xiàn)