SN-T 2635-2010水稻瘤矮病毒的檢疫鑒定方法

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T2635—2010水稻瘤矮病毒的檢疫鑒定方法2010-05-27發(fā)布2010-12-01實(shí)施國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局SN/T2635—2010本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國福建出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國廈門出入境檢驗(yàn)檢疫水稻瘤矮病毒的檢疫鑒定方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水稻瘤矮病毒檢疫鑒定的程序和方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻上水稻瘤矮病毒的檢測。2原理水稻瘤矮病毒學(xué)名：ricegallMa-fvirms,縮寫RGDV。水稻瘤矮病毒的分子生物學(xué)特性是本標(biāo)準(zhǔn)制定的主要依據(jù)；該病毒的分類地位、寄主范圍、病害癥狀、分布地區(qū)、傳播途徑、粒體形態(tài)、病毒基因組等參見附錄A。3儀器設(shè)備、用具及試劑3.1儀器設(shè)備高速冷凍離心機(jī)、微量天平(171000g)、PCR儀、實(shí)時(shí)爽光PCR-儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、pH計(jì)、微波爐、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋高壓滅圖附超凈工作臺(tái)等。3.2用具各種量程的可調(diào)移液器(1000L(2μL)、PCR反應(yīng)管、無RNase離心管(1.5mL)、研缽等。3.3.1TrizoL裂解液。3.3.25×TBE緩沖液硼酸27.5g0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL補(bǔ)充蒸餾水至1L。3.3.36×加樣緩沖液0.25%溴酚藍(lán)40%(質(zhì)量濃度)蔗糖水溶液。3.3.4三氯甲烷。3.3.5異丙醇。3.3.675%乙醇。3.3.7無水乙醇。3.3.8RT緩沖液。3.3.9dNTP:10mmol/L。23.3.10M-MLVRT:200U/μL。3.3.11Rnasin;40U/μL。3.3.12TaqDNA聚合酶。3.3.13PCR緩沖液。3.3.15引物和探針：RT-PCR引物見表1,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物和探針見表2。引物名稱引物序列產(chǎn)物大小退火溫度RGDV15'-CATTACTGTGCCGACCGAC-3’RGDV25’-ACACGACCCGCCTGTTACT-3表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的引物和探針序列引物名稱引物序列5'-ACTGTCGAAATTCGAACGAGGTA-3’5'-GGCACTCCGGTTTCAGCAT-3’5’-(FAM)TCCTACTCCCTTCAATCCAGCGCG4檢測與鑒定稱取0.1g樣品組織，用液氮研磨成粉末狀，迅速轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL離心管中，并加入1mLTrizoL試劑，劇烈振蕩后，室溫靜置5min;4℃,12000g離心10min,取上清液；加入三氯甲烷200μL,劇烈振蕩15s,室溫靜置3min;4℃,12000g離心15min,取上層水相；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置5min;4℃,12000g離心10min,棄上清液；加入1mL75%的乙醇洗滌沉淀2次，每次4℃,7500g離心5min,棄上清液；RNA沉淀干燥后，用20μL～40μL經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯)處在PCR管中加入3μL總RNA,1μLRGDV2引物，95℃水浴7min,迅速冰浴5min。再加入下(40U/μL)0.5μL、ddH?O4.0μL。37℃水浴60min,95℃水浴10min,自然冷卻至室溫，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系見表3,每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2個(gè)重復(fù)。檢測時(shí)以含有RGDV目標(biāo)片段的質(zhì)?；蚝《静牧献鳛殛栃詫φ?，以不含病毒的健康植物組織作陰性對照，同時(shí)以水代替模扳作為空白對照。3表3PCR反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物TaqDNA聚合酶(5U/μL)dNTPs(10mmol/L)10×PCR緩沖液(Mg2+Free)25mmol/L氯化鎂ddH?O總體積PCR反應(yīng)條件；94℃預(yù)變性3min,然后94℃變性45s、55℃退火50s、72℃延伸60s,35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃繼續(xù)延伸10min。4.4瓊脂糖凝膠電泳制備1.5%的瓊脂糖凝膠，然后將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按比例混合均勻，加入到樣品孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物作分子量標(biāo)記，進(jìn)行電泳(電壓110V～120V,0.5×TBE緩沖液體系)。電泳結(jié)束后，在裝有0.5μg/μL的溴化乙錠(EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗，再在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性DNA電泳帶，拍照，并保存照片。4.5RT-PCR結(jié)果判定如果陽性對照在778bp左右處有特異性條帶，陰性對照和空白對照無特異性擴(kuò)增，待測樣品出現(xiàn)與陽性對照一致的擴(kuò)增條帶，則判定為陽性。如果陽性對照、陰性對照和空白對照正確，待測樣品未出現(xiàn)與陽性對照一致的擴(kuò)增條帶，則判定為陰性。4.6序列測定PCR產(chǎn)物純化、回收后，進(jìn)行克隆、測序，或者直接測序。把測序所得到的核苷酸序列與已知的RGDV相應(yīng)序列進(jìn)行比對(利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST軟件進(jìn)行比對，網(wǎng)址為/BLAST/).4.7實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測反轉(zhuǎn)錄合成cDNA見4.2,然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。在25μL的反應(yīng)體系中加入：12.5μL2×PremixExTaq、1.0μL引物RGDVf(10μmol/L)、1.0μL引物RGDVr(10μmol/L)、Taqman探針RGDV-Probe(10μmol/L)0.5μL、cDNA3.0μL、ddH?O7.0μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s,然后95℃5s、60℃30s,共40個(gè)循環(huán)。4.8實(shí)時(shí)熒光RT-PCR結(jié)果判定如果陽性對照Ct值<35,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，陰性對照和空白對照的Ct值≥40,且無擴(kuò)增曲線。待測樣品Ct值≤35時(shí)，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判定為陽性。待測樣品Ct值35<Ct<40時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行測試，若重新測試的Ct值35<Ct<40,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，則判定為陽性；若重新測試的Ct值=40,則判定為陰性。5結(jié)果判定及記錄5.1結(jié)果判定當(dāng)RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR兩種檢測方法的檢測結(jié)果均呈陽性時(shí)，則判定為檢出RGDV。當(dāng)RT-PCR檢測結(jié)果呈陽性，測定的序列為RGDV序列(與已報(bào)道的RGDV序列同源性達(dá)90%以上),則判定為檢出RGDV。5.2結(jié)果記錄記錄好各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括樣品來源、種類、時(shí)間實(shí)驗(yàn)的時(shí)間、點(diǎn)、方法和結(jié)果等，并要有經(jīng)手人和實(shí)驗(yàn)人員的簽字。分子生物學(xué)檢測結(jié)果保留電承照片，序列調(diào)定結(jié)果保留測序報(bào)告圖。6樣品的保存經(jīng)檢測結(jié)果判定為陽性的樣品應(yīng)妥善保存在一20℃～—80℃超低溫冰箱中，并作好登記和標(biāo)記5SN/T2635—2010(資料性附錄)水稻瘤矮病毒的背景資料A.1分類地位分類地位：呼腸孤病毒科(Recairiduc)、植物呼腸孤病毒屬(Phytareovirus)。A.2寄主范圍已報(bào)道的自然寄主為水稻。A.3病害癥狀侵染水稻后引起嚴(yán)重矮縮，葉片短窄、硬直，莖節(jié)變短，葉色濃綠，分蘗減少，開花延遲，在葉背和葉鞘上長出淡黃綠色近圓形小瘤，大革A.4分布地區(qū)目前主要分布于泰國、馬來道亞、日本、朝鮮、韓國和我國等東南亞國家。A.5傳播途徑在自然界中主要由黑尾葉蠅(teps)(Reciladorsalis)以持久性方