熒光探針定量PCR技術原理及應用樣本

熒光探針定量PCR技術原理及應用

PCR技術是通過對基因選取性片段進行體外高效擴增，實現(xiàn)目基因檢測。熒光探針定量PCR（FQ-PCR）是一種新基因定量檢測技術，國外文獻多用“實時定量PCR（realtimequantitativePCR）”或“TaqManPCR(以美國PE公司商標命名)”。該技術是在常規(guī)PCR基本上加入熒光標記探針，巧妙地把核酸擴增（PCR）、雜交及光譜技術結(jié)合在一起，從而實現(xiàn)了對目基因準擬定量檢測，正發(fā)展成為臨床實驗診斷常規(guī)技術。1.原理

FQ-PCR工作原理[1-3]是運用Taq酶5’→3’外切酶活性，在PCR反映系統(tǒng)中加入一種熒光標記探針。該探針可與引物包括序列內(nèi)DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針5’端標以熒光報告基團FAM（6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518mm處），接近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA(6-羧基四甲基諾丹明,熒光發(fā)射峰值在582nm處)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞構(gòu)造。當探針保持完整時，5’端熒光報告基團所激發(fā)出熒光信號被3’端淬滅基因吸取或抑制，不浮現(xiàn)熒光信號變化。當PCR反映體系中有目基因存在，就會擴增出特異核酸片段，熒光探針即會依照堿基配對原理與之雜交。當PCR進入延伸（復制）期，Tap酶從引物3’端開始,隨新鏈延伸沿DNA模板移動，當移動到探針結(jié)合位置時，其5’→3’端外切酶活性作用，將探針切斷（切口平移效應）。熒光報告基團和淬滅基團間能量傳遞構(gòu)造被破壞，淬滅基團淬滅作用被解除，熒光報告基團熒光信號釋放出來（圖1）。PCR反映每復制一種特異核酸片段，就有一種探針被切斷，隨著一種熒光信號釋放。由于被釋放熒光基團數(shù)目和PRC產(chǎn)物是一對一關系，因而用熒光檢測技術檢測出熒光信號有無或強弱，即代表擴增產(chǎn)物有無或多少。由于熒光信號是代表擴增產(chǎn)物有效特異信號，無需進行有效和無效信號分離，實現(xiàn)了儀器實時檢測(圖2)，為新PCR定量原理創(chuàng)造了條件。

圖1.TaqManPCR反映模式

（A）聚合反映：（B）鏈置換；（C）裂解；

（D）聚合完畢（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）圖2.FQ-PCR實時動力學曲線

ABI公司一方面依照上述原理研制了ABI7700等系列定量PCR儀，在PCR反映中設立原則模板系列（普通5~7個原則濃度）反映管和空白對照管。通過實時檢測反映管中熒光信號，計算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光報告基團發(fā)光強度與淬滅基團發(fā)光強度比率，RQ-代表空白管中兩者比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號變化量。當熒光信號增強到某一閾值（依照熒光信號基線平均值和原則差，計算出以99.7%置信度不不大于平均值作為閾值）時，原則模板反映管所用循環(huán)次數(shù)（Ct值）就被記錄下來。Ct值與原則模板數(shù)量對數(shù)值之間有嚴格線性關系[3]，運用系列原則模板Ct值，制成原則曲線(圖3)，依照待測樣品Ct值，就可在原則曲線中擬定待測樣品起始DNA數(shù)量。依照數(shù)據(jù)解決，即可得出定量成果。探針設計普通應符合如下條件[2]：①探針長度應在20~40個堿基左右，以保證結(jié)合特異性。②GC堿基含量在40%~60%，避免單核苷酸序列重復。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結(jié)合穩(wěn)定限度要不不大于引物與模板結(jié)合穩(wěn)定限度，因而探針Tm值要比引物Tm值至少高出5℃。此外，探針濃度，探針與模板序列同源性，探針與引物距離都對實驗成果有影響。

圖3.FQ-PCR原則曲線

2.技術特點

2.1封閉狀態(tài)下檢測，避免了擴增產(chǎn)物污染而致假陽性

老式PCR于反映結(jié)束后取出反映液，通過電泳染色和紫外儀觀測成果。擴增產(chǎn)物在開放狀態(tài)下分析，對實險室污染是不可避免。因污染而導致假陽性，成為PCR臨床實驗診斷技術應用一種難以逾越障礙。FQ-PCR在全封閉狀態(tài)下實現(xiàn)PCR擴增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴增產(chǎn)物污染而導致假陽性。至于樣品間污染，無論從目基因數(shù)量、濃度還是顆粒大小分析，都比較容易控制。國內(nèi)PCR臨床應用浮現(xiàn)問題，產(chǎn)物污染所致假陽性是重要因素之一。

2.2基因定量檢測，擴展了臨床應用空間

老式PCR對基因檢測只能定性，不能定量重要是由擴增產(chǎn)物積累動力學所決定：①PCR產(chǎn)物在擴增過程中呈指數(shù)積累，當產(chǎn)物增長到一定限度，產(chǎn)物就停止了指數(shù)積累。不同起始模板，其指數(shù)增長期所用循環(huán)是不同，因而，不同數(shù)量基因樣品在同一循環(huán)次數(shù)中積累產(chǎn)物不能作為樣品基因定量根據(jù)；②PCR產(chǎn)物積累到一定限度就不能再增長，再進入平臺期。為了擴大PCR檢出敏捷度普通要增長循環(huán)次數(shù)，循環(huán)次數(shù)增長使得樣品目基因含量高反映管已進入平臺期，終產(chǎn)物量并不代表樣品目基因含量；③PCR反映管間擴增效率差別總是存在，既然PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，由擴增效率差別引起產(chǎn)物擴增差別也呈指數(shù)積累，增長循環(huán)次數(shù)勢必增長終產(chǎn)物差別，而減少循環(huán)次數(shù)又減少了檢測敏捷度。FQ-PCR采用實時檢測，使所有具有不同數(shù)量目基因均在同一條件（達到熒光閾值）下進行分析，因而更具備可比性。并且，這一條件處在擴增產(chǎn)物指數(shù)積累初期，合成產(chǎn)物所需dNTP、酶、離子均處在飽和最佳狀態(tài)，因此FQ-PCR循環(huán)參數(shù)與起始模板間有良好線性關系（有關系數(shù)＞0.95），實現(xiàn)了極為精準基因定量檢測。

2.3光譜技術進一步提高了敏捷度

FQ-PCR技術已用于單細胞基因診斷，敏捷度已達到極限水平，即檢測單拷貝基因，而老式PCR是不易做到。敏捷度提高得益于光譜技術。

2.4熒光探針雜交，進一步提高了特異性

PCR擴增中常會浮現(xiàn)非特異性擴增和引物二聚體，從而影響了對特異電泳帶判斷。FQ-PCR通過特異性探針雜交信號檢測PCR擴增產(chǎn)物，相稱于PCR反映過程中自動完畢了Southern雜交，進一步提高目基因檢測特異性。

2.5擴增與自動分析一體化，檢測更加簡便和迅速

FQ-PCR通過計算機和分析軟件，使PCR擴增、產(chǎn)物檢測和定量分析一體化，比老式定性PCR更為簡便和迅速，同步也避免了老式PCR產(chǎn)物分析中有害物質(zhì)對人體影響，計算和數(shù)據(jù)解決也有助于科研和臨床資料保存和分析。3.臨床應用概要

科學研究已經(jīng)證明，人類疾病大都直接或間接與基因關于，臨床實驗醫(yī)學正進入基因診斷時代。但對于許多疾病發(fā)生和發(fā)展來說，有關基因不是有無問題，而是一種從量變到質(zhì)變過程，基因定量檢測更具備臨床意義。

3.1感染性疾病

PCR在醫(yī)學檢查學中最有價值應用領域就是對感染性疾病診斷。理論上，只要樣本有一種病原體存在，PCR就可以檢測到。普通實驗室也能檢出10~102基因拷貝，而當前病原體抗原檢測辦法普通需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體檢測解決了免疫學檢測“窗口期”問題，可判斷疾病與否處在隱性或亞臨床狀態(tài)。

定量PCR研究資料已表白，病原體數(shù)量與感染性疾病病情輕重限度、傳染性及治療效果均有有關性。許多研究表白，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中病毒量明顯有關；有也研究表白，HIV病毒載量低于一定值時，沒有傳染性。

在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒數(shù)量與某些藥物療效有關。例如，干擾素治療對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具備明顯減少病毒高拷貝作

用。

3.2腫瘤

盡管腫瘤發(fā)病分子機制尚未完全清晰，但有關基因遺傳學變化積累，是致癌性轉(zhuǎn)變主線因素已被普遍接受。

癌基因表達增長和突變，在許多腫瘤初期和良性階段就可浮現(xiàn)。PCR技術不但能有效檢測基因突變，并且能精確檢測癌基因表達量，可據(jù)此進行腫瘤初期診斷、分型、分期和預后判斷。

幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測到原癌基因易位導致BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技術可通過檢測BCR/ABL融合基因表達擬定微量殘存惡性細胞存在數(shù)量，以此作為治療效果和預計復發(fā)危險性根據(jù)。

腫瘤標記物質(zhì)也是腫瘤診斷熱門研究領域。當前臨床對此多用免疫學辦法檢測，敏捷度低，普通需要達到108個分子數(shù)。用定量逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR辦法，普通條件下可檢出10-102某種標志物mRNA，可大大提高檢出率。

某些病毒致癌作用也與病毒載量關于，EB病毒載量FQ-PCR檢測成果已被用于鼻咽癌初期發(fā)現(xiàn)和隨訪。

3.3遺傳病

PCR技術初次臨床應用就是從檢測鐮狀細胞和β-地中海貧血基因突變開始?；蛲蛔兒腿笔Ь鶗鸶鞣N珠蛋白表達不平衡，用FQ-PCR檢測各種珠蛋白基因表達差別，是地中海貧血診斷有效手段。

總之，除與疾病直接有關基因檢測外，各種與疾病有關細胞因子、激素、受體，用FQ-PCR辦法檢測其基因表達水平具備更高敏捷性，更有助于疾病診斷。參照文獻

[1]LivaKJ，F(xiàn)loodSJA，MarmaroJ，etal.Oligonucletideswithfluorescentdyesat

oppositeendsprovideaquenchedprodesystemusefulfordetectingPCRproductandnucleicacidhybridization.PCRMethodsApplic，1995,4:357-362.

[2]HollandPM，AbramsonRD，WastonR，etal.Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5′to3′exonucleaseactivityofthe

themusaquaticusDNApolymerase.ProcNatAcaSciUSA,1991,88:7276-7280

[3]HiguchiR，DollingerG，WalshPS，etal.Stimutaneousamplificationand

detectionofspecificDNAsequences.Biotechnology，1992，10:413-417.一熒光探針定量PCR定量檢測意義

定量檢測與定性檢測最大區(qū)別就在于，定性只是檢測病原體核酸“有”或“無”，而定量可以檢測病原體核酸量“多”或“少”。

定量檢測意義：體現(xiàn)病原體含量與復制水平、感染限度之間關系。評價和考核治療效果。用于傳染病發(fā)病監(jiān)控、預測與防止。作為新愈后指標。建立新病原體分子診斷原則。新藥物及療法研究與開發(fā)。二熒光定量PCR報告成果讀取：

熒光定量PCR是直接擴增病原體特異性DNA或cDNA，其成果反映了標本中DNA或RNA存在多少，成果通慣用數(shù)字表達，

報告為“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”，copy即“拷貝”，表達病原體基因組個數(shù)，該數(shù)據(jù)越大，表白病原體在體內(nèi)復制得越厲害，傳染性越強。

例：HBV-DNA定量成果報告：3.637×104IU/ml（如果采用科學記數(shù)法表達為：3.637E+04），代表每ml血液中具有36,370國際單位乙肝病毒分子。

如果待檢標本可以定量，如血液等，成果報告為多少copies/ml或2U/ml。

如果待檢標本不易定量，如分泌物、痰液等，成果只報告為多少copies。乙型肝炎病毒（HBV）

一乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染

HBV感染是全球性公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織記錄，全世界乙肝病毒攜帶者有3.5億人之多。國內(nèi)人群HBV攜帶率約為10%，有近1.3億人感染HBV，是世界上最大“肝炎大國”。

HBV感染后臨床體現(xiàn)呈多樣性，可體現(xiàn)為重癥肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或無癥狀攜帶者，其中某些慢性肝炎可演變成肝硬化或肝癌。HBV攜帶者因無癥狀，不易被察覺，其作為傳染源危害性比患者更甚。

HBV病毒顆粒呈球形，具備雙層衣殼，HBsAg鑲嵌于脂質(zhì)雙層外衣殼中。HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染重要標志，可刺激機體產(chǎn)生保護性抗體即HBsAb。

HBcAg位于內(nèi)衣殼某些，其外被HBsAg所覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出。其抗原性較強，能刺激機體產(chǎn)生HBcAb。HBcAblgG在血中持續(xù)時間較長，為非保護性抗體。HBcAblgM提示HBV處在復制狀態(tài)。

HBeAg是PreC基因（前核基因）編碼產(chǎn)物，是一種非構(gòu)造性蛋白，為可溶性蛋白質(zhì)，自肝細胞分泌入血中。HBeAg消長與病毒體DNA聚合酶消長一致，故可作為HBV復制及強感染性指標。其刺激機體產(chǎn)生HBeAb，對HBV感染有一定保護作用，普通以為HbeAb浮現(xiàn)是預后良好征象。

在這三對抗原、抗體系統(tǒng)中，核心抗原較難檢測到，普通不作為臨床常規(guī)檢查，故稱為“兩對半”。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三項陽性稱為“大三陽”，HBsAg、HBeAb、HBcAb三項陽性稱為“小三陽”。

二“兩對半”檢測與HBV-DNA定量

“兩對半”是從免疫學水平來檢測HBV感染機體后引起免疫應答，產(chǎn)生相應抗原抗體含量（這個“含量”還不是定量，而只是抗原抗體“有”或“無”），它事實上測定是機體感染HBV后免疫應答成果反映。由于個體反映差別，不同人在感染HBV后會浮現(xiàn)不同免疫應答，從而得到不同“兩對半”成果模式。如產(chǎn)生抗體、體現(xiàn)為“攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等等。但是所有這些免疫學指標不能反映患者或病人體內(nèi)病毒復復水平及傳染限度，不能提示其與乙型肝炎發(fā)生和發(fā)展過程之間聯(lián)系。

熒光探針定量PCR技術則是從分子生物學水平直接檢測HBV病毒自身遺傳物質(zhì)DNA，是病毒存在和復制最可靠、最直接指標。

HBsAg雖然是HBV感染標志，但在感染初期，或由于S基因（編碼HBsAg）低水平表達或變異，常規(guī)辦法難以檢出，會導致漏檢。HBV-DNA檢測比免疫學檢測更初期、更敏捷。免疫學辦法檢測為HBsAg(—)病人中，約有3%以上檢測出HBV-DNA(+),健康供血者用PCR辦法檢測HBV-DNA，也有一定比例陽性。HBsAg陰性慢性肝炎中，仍有某些是HBV感染引起。因此單憑HBsAg陽性與否來判斷肝臟中HBV復制及有無傳染性是遠遠不夠，易導致某些慢性型病毒性肝炎漏診。對于HBsAg陰性或有HBV感染后任何血清學根據(jù)都應進一步進行HBV-DNA熒光定量檢測。也有時浮現(xiàn)HBeAg(—)而HBV-DNA(+)成果，這是由于編碼e抗原PreC區(qū)基因極易浮現(xiàn)變異，在PreC區(qū)浮現(xiàn)終結(jié)密碼子，使PreC區(qū)基因與C區(qū)基因不能轉(zhuǎn)譯出完整e抗原，導致HBeAg表達缺失，機體感染HBV不表達HBeAg，固然血清學辦法也不能檢測出HBeAg存在。

HBsAg(+)患者中大概有1-10%檢測不出HBV-DNA，這種狀況在世界各國均有報道。一方面，由于HBV-DNA整合于宿主細胞基因組，或基因變異，與慣用PCR引物、探針不匹配，PCR擴增不出相應基因序列，因而未能檢出。此外，由于HBV復制有反轉(zhuǎn)錄過程，S基因（編碼表面抗原）可以以2.1KbRNA為mRNA轉(zhuǎn)譯成HBsAg，故在某些HBV感染中雖無病毒復制，但可長期產(chǎn)生HbsAg。5～10%HBV感染者體現(xiàn)為單項HBcAb陽性。有許多報道證明，單項HBcAb陽性血液可以引起HBV輸血后感染。如果同步檢查HBV-DNA，可以減少漏檢，防止輸血后肝炎發(fā)生。

應用PCR檢測發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)“大三陽”病人血中可以檢出HBV-DAN（檢出率約為96%左右），有相稱一某些人e抗原轉(zhuǎn)化e抗體后，即“大三陽”轉(zhuǎn)化為“小三陽”后，其血清中仍有DNA存在(檢出率約為30%)，闡明病毒仍未消失和停止復制。“小三陽”病人血清中HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率約為60-70%，這與病毒遺傳物質(zhì)突變或與宿主基因組整合、用藥后復制暫停、以及血清HBV病毒炎癥清除使血清中HBV-DNA消失或下降至極低濃度（低于檢測下限）關于，這種狀況下并不表達病人恢復，應隨訪并復查血清HBV-DNA以免誤癥。

要特別指出是，近年來由于抑制病毒復制核苷類藥物藥物（如拉咪呋啶）在臨床大量使用，使得HBV-DNA復制水平也許會在短時期內(nèi)迅速減少至不可檢測水平（這時候免疫學檢測指標可不發(fā)生變化），但是隨著患者浮現(xiàn)藥物耐受或產(chǎn)生基因突變，HBV-DNA復制水平又也許呈現(xiàn)一種上升趨勢，從而使HBV-DNA定量檢測浮現(xiàn)相對復雜動態(tài)變化成果。三熒光探針PCR定量檢測HBV-DNA意義

（一）HBV-DNA定量檢測，臨床上以＜103copies/ml為檢測臨界值，可作為乙肝病毒無復制狀態(tài)或低水平復制指標。慢性乙肝患者血清中HBV-DNA＞105copies/ml患者，如果體內(nèi)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平異常，應考慮接受抗病治療。

（二）HBV-DNA定量檢測是直接對HBV遺傳物質(zhì)DNA進行基因擴增，是病毒復制和存在最初期、最敏捷也是最可靠指標，可對HBV感染作出初期診斷。乙肝病人傳染性與其血清中HBV-DNA含量高低呈正有關，病人血清中HBV-DNA復制水平越高，其傳染性越強。

（三）乙肝治療當前尚無特效辦法，慣用有干擾素和拉咪呋啶。臨床上普通以為用藥后HBV-DNA下降到105copies/ml如下為對藥物完全應答；定量下降不不大于2個數(shù)量級(102)為對藥物某些應

答；未達上述原則為低應答或無應答。研究表白，對于干擾素治療：(1)治療前HBV低水平復制者對

干擾素反映性明顯優(yōu)于高水平復制者。HBsAg轉(zhuǎn)陰幾乎都是那些治療前血清HBV-DNA含量較低者，而治療前HBV-DNA含量特別高者大多療效不佳；(2)治療中病毒復制水平迅速減少者，有望治愈。相反，治療期間HBV-DNA水平下降較慢，或下降幅度較小，或變化不明顯者，大多治療無效；(3)治療結(jié)束后，采用PCR定量法監(jiān)測，HBV-DNA完全轉(zhuǎn)陰一年以上者，也許不再復發(fā)，而終結(jié)治療后HBV-DNA仍保持較低水平者，反跳也許性較大。核苷類藥物拉咪呋啶有明顯減少高病毒載量作用，近期療效頗有優(yōu)勢，但是長期使用可導致HBV基因突變，患者易產(chǎn)生耐受性，且易浮現(xiàn)停藥后反彈。

（四）肝移植前患者血清HBV-DNA水平高低決定移植后肝臟與否再感染HBV。由于HBV重要侵犯肝臟，建議移植前使用抗HBV藥物，最大限度減少血清HBV-DNA濃度，有助于防止HBV侵犯移植后肝臟，提高肝臟移植效果。

（五）乙肝婦女懷孕邁進行定量PCR測定，有助于選取有利懷孕時機，要選取低病毒載量時受孕。乙肝孕婦懷孕期間定期進行定量PCR檢查，有助于使某些病人得到及時、對的診斷，減少宮內(nèi)感染風險；母—嬰傳播多發(fā)生于胎兒期和圍生期。特別是HBsAg和HBeAg雙陽性媽媽，體內(nèi)HBV-DNA復制水平相對較高，發(fā)生胎內(nèi)傳播和圍生期感染機率均較高。因HBV可通過乳汁直接傳染給嬰兒，哺乳期婦女，除血液檢測外，還應進行乳汁HBV-DNA檢測，以決定與否母乳飼養(yǎng)。丙型肝炎病毒(HCV)

一丙肝病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染

丙型肝炎呈全球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病最重要因素。據(jù)世界衛(wèi)生組織記錄，全球HCV感染率約為3%，預計約1.7億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例。

丙肝病毒呈球形，有包膜，是一種單正鏈RNA病毒，重要在肝細胞內(nèi)復制?；蚪M由9個基因區(qū)構(gòu)成，編碼糖基化包膜蛋白E1區(qū)和E2區(qū)基因極易浮現(xiàn)變異。丙肝病毒體外培養(yǎng)至今尚不成功。

HCV感染引起臨床過程輕重不一，可體現(xiàn)為急性肝炎、慢性肝炎或無癥狀攜帶者。HCV感染重要特性是易于慢性化，急性期后易于發(fā)展成慢性肝炎，某些病人可進一步發(fā)展為肝硬化或肝癌。40%~50%丙肝患者可轉(zhuǎn)變成慢性肝炎。多數(shù)慢性肝炎患者臨床體現(xiàn)不明顯，發(fā)病時已呈慢性過程，約20%慢性肝炎可發(fā)展成肝硬化。HCV感染與肝癌發(fā)生有密切關系，在乎大利、希臘、日本等國肝癌患者血中，50%~70%抗-HCV陽性，國內(nèi)肝癌患者血中約10%存在抗-HCV陽性。用RT-PCR技術可從約10%肝癌組織中檢出HCR-RNA。

HCV重要通過輸血傳播，是輸血后肝炎致病因子。免疫學標志僅有抗-HCV一項，為非中和抗體。

全國血清流行病學調(diào)查資料顯示，國內(nèi)普通人群抗-HCV陽性率為3.2%。各地抗-HCV陽性率有一定差別。

HCV在體內(nèi)呈低水平復制，病毒血癥水平較低，不易誘導高水平免疫應答；HCV亦可存在于肝外組織或外周血單核細胞中，使病毒感染不易清除。由于E1區(qū)和E2區(qū)基因具備高度變異性，導致丙肝病毒包膜蛋白抗原性迅速變異，這種變異引起免疫逃避作用，是病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，感染易于慢性化重要因素，也是丙肝病毒疫苗研制最大障礙。不同地區(qū)不同個體、同一種體不同步期、同同樣品不同克隆之間，丙型肝炎病毒基因序列都存在著差別性。二熒光探針PCR定量檢測HCV-RNA意義

（一）HCV-RNA熒光定量PCR檢測，臨床上以＜80copies/ml為檢測臨界值，可作為丙肝病毒無復制狀態(tài)或低水平復制指標。慢性丙肝患血清中HCV-RNA＞103copies/ml患者應接受抗病毒治療。血清HCV-RNA＜107copies/ml患者抗病毒治療療效常優(yōu)于HCV-RNA含量更高者。

（二）熒光探針PCR定量檢測HCV-RNA可以大大提高檢測窗口期。暴露于HCV后1～3w，在外周血可檢測到HCV-RNA。丙肝免疫學指標只有抗-HCV抗體一項，血清學篩查HCV抗體“窗口期”約達三個月之久。在急性HCV感染者浮現(xiàn)臨床癥狀時，僅50%～70%患者抗-HCV陽性，3個月后約90%患者抗-HCV轉(zhuǎn)

陽，少數(shù)人感染HCV后不產(chǎn)生抗-HCV。故在免疫學檢測“窗口期”或一某些不產(chǎn)生抗體丙肝病毒攜帶者，都可浮現(xiàn)HCV-RNA(+)，抗-HCV(-)檢測成果。

（三）慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這只表達曾經(jīng)感染了丙肝病毒并浮現(xiàn)了相應免疫應答，并不代表體內(nèi)仍有丙肝病毒存在或復制，這時只能通過HCV-RNA定量檢測鑒別丙肝病毒活動性和復制限度。有人抗-HCV陽性，但可體現(xiàn)為ALT水平正常，HCV-RNA(-)。固然也不排除由于HCV基因變異，或是PCR抑制效應而導致假陰性成果。

（四）HCV-RNA病毒載量與抗-HCV滴度以及ALT水平呈正有關，抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增長。HCV-RNA常在ALT恢復正常前轉(zhuǎn)陰，但也有ALT恢復正常而HCVRNA持續(xù)陽性者。

（五）HCV-RNA病毒載量高低與疾病嚴重限度和疾病進展并無絕對有關性，但可作為抗病毒療效評估觀測指標。丙型肝炎治療有一定療效，治療后血清HCV-RNA轉(zhuǎn)陰率可高達50%～80%，但停藥后約半數(shù)HCV-RNA又轉(zhuǎn)陽，復發(fā)時間多在治療后6～12個月，若治后12個月ALT持續(xù)正常，血清HCV-RNA陰性，則也許治愈?？?HCV陰轉(zhuǎn)與否不能作為抗病毒療效指標。

（六）HCV重要在肝臟內(nèi)進行復制，肝移植后丙型肝炎復發(fā)與移植時HCR-RNA水平及移植后免疫抑制限度關于。

（七）HCV重要通過輸血和血制品傳播，同步，未經(jīng)嚴格消毒手術器械、注射器等也是其經(jīng)破損皮膚和黏膜傳播重要途徑。醫(yī)療糾紛呈倍增長年代，面對醫(yī)療糾紛中“舉證倒置”，更有必要對病人，特別是手術和接受輸血病人進行入院先后HCV-RNA定量檢測。結(jié)核分枝桿菌（TB）

一結(jié)核分枝桿菌(tuberclebacilli，TB)感染

結(jié)核桿菌屬分枝桿菌屬，因繁殖時有分枝生長趨勢而得名。由于菌體含大量分枝菌酸，故不易著色，但在加溫或延長染色時間著色后能抵抗鹽酸乙醇脫色，故又稱抗酸桿菌。

結(jié)核桿菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。隨著抗結(jié)核藥物不斷發(fā)展和衛(wèi)生狀況改進，世界各國結(jié)核發(fā)病率和死亡率曾大幅度下降。20世紀80年代后來，由于艾滋病流行以及結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株浮現(xiàn)，結(jié)核病發(fā)病率又有不斷上升趨勢WHO最新記錄，全球每年新發(fā)病例800萬左右，其中發(fā)展中華人民共和國家占95%。

國內(nèi)第四次全國結(jié)核病流行病學調(diào)查成果表白，國內(nèi)有4～5億人已受結(jié)核分枝桿菌感染，預計全國有活動性肺結(jié)核患者451萬。全國結(jié)核病死亡率為44.5%，每年死于結(jié)核病者達13萬人，

為各種其他傳染病和寄生蟲病死亡總和2倍。青壯年結(jié)核病死亡占結(jié)核病死亡48%。當前，國內(nèi)結(jié)核病流行形勢仍十分嚴峻，結(jié)核病尚未得到有效控制，為全球結(jié)核病高承擔國家之一。其特點為高感染率，高患病率，高死亡率，高耐藥率，低遞降率，農(nóng)村疫情高于都市，青壯年結(jié)核病患病和死亡比例高。

結(jié)核桿菌侵入肺泡后被巨噬細胞吞噬，由于菌體具有大量脂質(zhì)，能抵抗巨噬細胞殺菌作用而大量繁殖，導致巨噬細胞裂解，釋放出大量細菌而引起肺泡滲出性炎癥，形成原發(fā)性結(jié)核。原發(fā)性肺結(jié)核多見于小朋友。

繼發(fā)感染多見于成年人。當人體抵抗能力下降時，殘存于原發(fā)灶結(jié)核分枝桿菌會再度大量繁殖而發(fā)病，且容易發(fā)生肺部干酪樣壞死和空洞形成，菌可隨痰排出，稱為開放性結(jié)核。

某些患者，結(jié)核桿菌可經(jīng)血液、淋巴液擴散侵入肺外組織器官，引起相應臟器結(jié)核，如腦、腎、骨、關節(jié)、生殖器官等結(jié)核。艾滋病等免疫力極度低下者，嚴重時可導致全身播散性結(jié)核。痰菌被咽入消化道也可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。結(jié)核桿菌肺外感染在臨床上更容易誤診。近年來有許多報道，肺外結(jié)核標本中結(jié)核分枝L型檢出率比較高，應引起足夠注重。二結(jié)核桿菌檢測辦法學討論及熒光定量PCR檢測TB-DNA意義

結(jié)核病是一種感染性疾病，病因很明確，實驗室診斷是確診重要根據(jù)。

（一）最簡樸、迅速、經(jīng)濟也是最慣用診斷辦法是通過涂片染色直接觀測抗酸桿菌，但是這種辦法敏捷性很差，對于結(jié)核桿菌感染者，其檢出率只有30%左右。60%以上肺結(jié)核病人以及75

%肺外結(jié)核病人都不能通過這種老式辦法檢測出來。抗酸染色另一局限是特異性問題，它只能做到分枝桿菌屬鑒定，而無法將結(jié)核桿菌和基她分枝桿菌區(qū)別開來。涂片陽性只表白存在抗酸桿菌，涉及約85%結(jié)核分枝桿菌和15%非結(jié)核分枝桿菌都可以抗酸染色陽性。

（二）作為結(jié)核病診斷“金原則”細胞培養(yǎng)法，普通要4—8w時間最快者也要2w才干出陰性/陽性成果，費時費事，延誤診斷，有悖于結(jié)核桿菌迅速診斷規(guī)定。

（三）結(jié)核菌素實驗作為結(jié)核輔助診斷已經(jīng)存在數(shù)十年之久了，但是卻沒有較好說服力，由于非結(jié)核分枝桿菌也有致敏作用而導致假陽性。結(jié)核桿菌始終沒有找到病原性特異單一抗原或是保護性特異單一抗原。人們做了無多次嘗試，但愿可以成功開發(fā)出在臨床上應用診斷結(jié)核血清學試劑盒，但都以失敗而告終。在開發(fā)這種檢測試劑一次次摸索中，大量蛋白和非蛋白抗原（如酰基海藻糖，苯酚糖酯）被發(fā)掘出來，但都沒有太大臨床價值。由于結(jié)核分枝桿菌跟其她某些也許致病或主線不致病微生物具備大量相似抗原蛋白，因此想在臨床上尋找一種適合于ELISA辦法抗原十分困難。

（三）隨著分子生物學技術發(fā)展，特別是在核酸擴增和雜交領域獲得重大進展，有助于改正現(xiàn)存結(jié)核診斷辦法中存在缺陷。采用熒光探針定量PCR辦法檢測臨床標本中結(jié)核桿菌DNA是迅速診斷結(jié)核桿菌感染一種非常有前程辦法，特別是對于因菌量少，或細菌發(fā)生L型變異而不易分離培養(yǎng)成功標本更有實用價值。當前，熒光探針PCR辦法檢測結(jié)核桿菌已經(jīng)得到了國家藥物監(jiān)督管理局(sFDA)批準，在全國推廣使用。

（四）熒光定量PCR法能穩(wěn)定檢測10copies結(jié)核桿菌基因組DNA，敏捷度高，特異性強。一定比例涂片或培養(yǎng)陰性病人，PCR檢測可為陽性。該法檢測活動性肺結(jié)核患者痰和外周血陽性率分別為49.0%和51.6%、結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血陽性率分別為45.4%和38.5%，以及結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液和外周血陽性率分別為50.8%和42.6%，檢出結(jié)核桿菌陽性率明顯高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。

（五）若有浮現(xiàn)涂片陽性，而PCR檢測成果為陰性，首要考慮非結(jié)核分枝桿菌感染。另一方面考慮操作因素，在痰液標本解決過程中，如果痰液化不夠，細菌在離心過程中不能沉淀到試管底部而隨上清一起去掉，會導致PCR成果假陰性。

（六）熒光定量PCR法能反映抗結(jié)核治療過程中痰標本中結(jié)核桿菌數(shù)量變化，對抗結(jié)核藥物療效有一定監(jiān)控效果。但是PCR并不能區(qū)別死菌與活菌，因此對于某些已經(jīng)治愈結(jié)核病患者，肺內(nèi)若有死結(jié)核桿菌殘留，仍可抽提到DNA，PCR檢測仍可為陽性成果。

（七）對不同感染部位標本進行TB-DNA擴增和檢測，即可診斷相應部位與否存在結(jié)核桿菌感染。

1．痰或支氣管灌洗液TB-DNA檢測可輔助診斷肺結(jié)核病。

2．血液（白細胞）TB-DNA檢測可輔助診斷播散性肺結(jié)核和各臟器肺結(jié)核病。

3．腦脊液TB-DNA檢測可輔助診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病。

4．宮頸拭子或尿液TB-DNA檢測可輔助診斷泌尿生殖道結(jié)核病。

5．胸腹水TB-DNA檢測可以輔助診斷結(jié)核性胸膜炎。

肺炎衣原體(CP)一肺炎衣原體(chlamydiapneumonia，CP)感染

肺炎衣原體重要寄生于人類呼吸道，是引起呼吸道感染重要病原體之一。人類是肺炎衣原體惟一宿主。

肺炎衣原體系人與人之間經(jīng)飛沫或呼吸道分泌物傳播，在密切接觸家庭或在人群密集醫(yī)院等公共場合更易傳播。其感染擴散速度較為緩慢，具備散發(fā)和流行交替浮現(xiàn)特點，在人群中流行可持續(xù)6個月左右。

CP重要引起青少年急性呼吸道感染，特別引起小朋友咽炎、鼻竇炎、支氣管炎和肺炎等。潛伏期平均30d左右，起病緩慢，臨床體現(xiàn)為咽痛、聲音嘶啞、發(fā)熱、咳嗽和氣促等癥狀，還可引起心包炎、心肌炎和心內(nèi)膜炎。CP感染所引起肺炎患者1～2w上呼吸道感染癥狀消失，而咳嗽加重，可持續(xù)1至2個月。老年患者臨床體現(xiàn)不易與其她因素引起肺炎相區(qū)別，持續(xù)性咳嗽是本病重要特點。半數(shù)肺炎患者常伴有結(jié)膜炎，也可引起肺外癥狀如紅斑結(jié)節(jié)、甲狀腺炎、格林-巴利綜合征等。

近年來發(fā)現(xiàn)CP與冠狀動脈硬化性心臟病發(fā)生關于。采用免疫組化、分子生物學和病理學研究成果證明在冠狀動脈粥樣硬化病灶中存在肺炎衣原體。不但有肺炎衣原體梨形構(gòu)造，并且病理切片用抗肺炎衣原體特異單克隆抗體解決后呈陽性。也有資料表白肺炎衣原體慢性感染及其所形成免疫復合物對冠狀動脈損害，也許是引起冠狀動脈硬化性心臟病病理變化一種重要因素之一，但尚需進一步證明。

肺炎衣原體在激發(fā)哮喘中亦也許發(fā)揮作用。

在肺癌、支氣管擴張患者中CP檢出率也相對較高。

CP感染患者外周血白細胞計數(shù)大多正常，胸片無特異性，多為單側(cè)下葉浸潤，體現(xiàn)為節(jié)段性肺炎，嚴重者呈廣泛雙側(cè)肺炎。

二肺炎衣原體檢測辦法學討論及熒光探針PCR檢測CP-DNA

意義

肺炎衣原體是嚴格細胞內(nèi)寄生，必須在活細胞內(nèi)才干生長，因此培養(yǎng)條件規(guī)定更高也更不容易，普通采用HEp-2t和Hela細胞株進行培養(yǎng)，再用熒光特異性單克隆抗體來鑒定細胞培養(yǎng)中肺炎衣原體，但是這種辦法周期長，檢出率低，并不適應于臨床檢測。

血清學辦法檢測肺炎衣原體特異性抗體，微量免疫熒光（MIF）實驗檢測肺炎衣原體較為敏感。凡雙份血清抗體滴度增高4倍或以上；或單位血清特異性IgM抗體≥1：16或IgG抗體≥1：512，有一定診斷價值。

分子生物學檢測，采用限限制性內(nèi)切酶PstI對肺炎衣原體DNA進行酶切后，可獲得一條474bpDNA片段，而沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體卻沒有這種DNA片段。事實上由于標本中病原體數(shù)目很少，酶切辦法往往是在細胞培養(yǎng)或PCR擴增后進行。但是酶切辦法由于成本較高且操作復雜，并不合用于臨床檢測。

近年來發(fā)展起來熒光探針PCR辦法，直接擴增患者痰液、鼻洗液、咽拭子或支氣管洗液等標本中（取材用深部痰液，小兒用吸痰器吸取深部痰液效果最佳，用鼻咽拭子需要在上腭懸雍垂后部涂擦取分泌物拭子）肺炎衣原體特異性核酸片段，操作簡樸、敏捷度高、特異性強，同步避免了常規(guī)PCR技術操作復雜和擴增產(chǎn)物污染帶來假陽性等問題，被迅速應用于肺炎衣原體感染臨床檢測。

同樣熒光探針PCR檢測還可用于觀測肺炎衣原體感染治療效果，有效治療后，標本中CP-DNA拷貝數(shù)會相應地下降或轉(zhuǎn)陰。肺炎支原體(MP)

一肺炎支原體(mycoplasmapneumonia，MP)感染

在正常人和動物上呼吸道分泌物中可分離出各種支原體，闡明絕大多數(shù)支原體構(gòu)成人和動物正常菌群。而當前所能擬定引起人類呼吸道感染性疾病也只有肺炎支原體，重要引起人類支原體肺炎。

MP重要引起呼吸道外源性感染，普通通過飛沫傳播，一種四季均可發(fā)病，但多發(fā)生在夏末秋初季節(jié)，以1～15歲人群發(fā)病率較高，占小兒肺炎20%左右，在人口密集場合或區(qū)域可達50%。嬰幼兒發(fā)病率最高，占25～69%，病情嚴重者可發(fā)生死亡。

MP感染重要引起支原體肺炎，其病變?yōu)橥|(zhì)性肺炎，亦可合并支氣管肺炎，故曾稱為原發(fā)性非典型性肺炎。潛伏期約為2～3w，臨床癥狀有不規(guī)則發(fā)熱，體溫可達39℃，熱程在1～3w左右。臨床癥狀輕重不一，重要體現(xiàn)為頭痛，刺激性咳嗽。嬰幼兒病情較重，發(fā)病急，病程長，以呼吸困難為主，重要癥狀普通在10d后減輕，由于局部炎癥導致咳嗽持續(xù)時間較長，并引起支氣管壁肥厚。

支原體肺炎約占非細菌性肺炎1/3以上，或各種因素引起肺炎10%。MP感染與小兒支氣管炎哮喘密切有關。

除支原體肺炎外，尚可引起肺外感染，咽喉炎、鼻炎、中耳炎、氣管炎和支氣管炎等。

實驗室檢查周邊血白細胞普通正常或有輕度增多。

胸部X線變化各種各樣，最常用是兩肺下葉片狀支氣管肺炎。二肺炎支原體檢測辦法學討論及熒光探針PCR檢測MP-DNA意義

肺炎支原體可從咳痰或咽拭子中培養(yǎng)出來，培養(yǎng)條件規(guī)定較高，分離和鑒定需1～2w，許多醫(yī)院實驗室無法做此項檢查，且周期太長，陽性率低，因而對臨床協(xié)助不大。

普通染色法不易著色。由于沒有細胞壁，具備較大可塑性,呈現(xiàn)高度多態(tài)性，形態(tài)學辦法難以鑒別。

冷凝集實驗，僅有50%左右患者浮現(xiàn)陽性，且此反映為非特異性，呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、流感等也可浮現(xiàn)冷疑集素效價升高，故只能做為輔助診斷。

酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，免疫熒光法、金標免疫斑點法等都是用血清學水平檢測抗體，IgG(+)不能區(qū)別既往感染與現(xiàn)癥感染，IgM(+)浮現(xiàn)是急性近期感染標志，有一定診斷價值，有報道顯示IgM陽性率但是30%，IgM(-)并不能排除MP感染。

近年來有應用單克隆抗體采用ELISA雙抗體夾心法檢測支原體肺炎患者痰、鼻洗液和支氣管洗液中42kDa多肽或190kDaP1蛋白抗原報道。事實上，這些標本中病原體抗原含量極微，不易檢出，使得直接檢測蛋白抗原辦法應用受限。

熒光探針PCR通過直接擴增痰液、鼻洗液、咽拭子或支氣管洗液等標本中（取材用深部痰液，小兒用吸痰器吸取深部痰液效果最佳,用鼻咽拭子需要在上腭懸雍垂后部涂擦取分泌物拭子）肺炎支原體核酸，具備迅速、敏感度高、特異性強等特點，為支原體檢測和實驗研究開辟了一種遼闊前景。

熒光探針PCR檢測還可用于觀測肺炎支原體感染治療效果，據(jù)報道，有效治療2～3w后，PCR檢測可所有轉(zhuǎn)陰。淋病奈瑟菌(NG)

一淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae，NG)感染

淋病奈瑟菌俗稱淋球菌，是人類淋病病原菌，人是淋球菌唯一宿主。

淋球菌重要通過性接觸傳播，侵入尿道和生殖道，其潛伏期為2～5d，引起人類泌尿生殖系統(tǒng)黏膜急性或慢性化膿性感染，是國內(nèi)當前流行發(fā)病率最高性傳播病癥，也是導致不育因素之一。

成人感染初期，普通引起男性前尿道炎，女性尿道炎與子宮頸炎。患者癥狀為：尿痛、尿頻、尿道流膿、宮頸可見膿性分泌物等。如進一步擴散到生殖系統(tǒng)，引起慢性感染，如男性發(fā)生前列腺炎，精囊，精索炎和附睪炎；女性浮現(xiàn)前庭大腺炎和盆腔炎等。媽媽患有淋球性陰道炎時或子宮頸炎時，嬰兒出生時易患上淋球菌性結(jié)膜炎。

人對淋球菌感染無天然抵抗力，多數(shù)患者可以自愈，并浮現(xiàn)特異IgG、IgM、IgA，但是免疫不持久，再感染和慢性患者普遍存在。

當前，淋病發(fā)病趨勢為高收入階層發(fā)病下降，普通收入階層發(fā)病率增長，大都市人口感染逐漸下降，中小都市人口感染增長，淋病從都市走向農(nóng)村，農(nóng)村病人增多。

由于病人多隱瞞病史(接觸史)，給診斷帶來困難，延誤治療。二淋球菌感染實驗室診斷及熒光探針定量檢測NG-DNA意義

（一）涂片：將患者膿性分泌物涂片，革蘭氏染色后鏡檢，如在中性粒細胞內(nèi)發(fā)既有革蘭氏陰性雙球菌時，結(jié)合臨床癥狀和病史（接觸史），有診斷價值。涂片法對于典型男性淋病患者，檢出率較高，但是對于女性患者，由于其分泌物中脫落細胞和抗酸桿菌等間雜其中，使得背景難以辨認，檢出率很低，容易浮現(xiàn)假陰性成果。

（二）培養(yǎng)：標本在選取性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可浮現(xiàn)典型菌落。氧化酶實驗陽性。取典型菌落作細菌涂片可見到革蘭陰性雙球菌，即可診斷。但是淋球菌抵抗力極弱，離開宿主后很容易死亡，不容易分離培養(yǎng)成功。

（三）熒光探針PCR技術直接對可疑患者分泌物中淋球菌DNA進行基因擴增，可在短時間內(nèi)迅速、精確地直接從臨床各種標本中檢出含量極低病原菌。對女性疑似淋球菌引起各種炎癥診斷及鑒別診斷起決定性作用；對男性疑似淋球菌引起各種炎癥診斷和鑒別診斷有著重要意義。

（四）在淋球菌傳播中，癥狀輕者或無癥狀淋球菌感染者是更重要傳染源，熒光探針PCR檢測優(yōu)勢還在于可對這一某些患者做到初期診斷和鑒別診斷，對防止和治療性病意義重大。

（五）同樣，淋球菌DNA檢測也可用于療效考核。有效抗菌治療后，標本中淋球菌DNA拷貝數(shù)會相應下降，在治愈后轉(zhuǎn)陰。解脲脲原體(UU)

一解脲脲原體（ureaplasmaurealyticum，UU）感染

解脲脲原體又叫解脲支原體、溶脲脲原體，是支原體一種，由于可以合成尿素酶分解尿素而命名。現(xiàn)已明確解脲脲原體是引起性傳播疾病病原體之一。解脲脲原體重要致病因素是掠奪宿主細胞膜固醇等脂類營養(yǎng)，分解尿素，產(chǎn)生大量毒性代謝產(chǎn)物氨類，損害細胞，并可增進局部形成結(jié)石。

在非淋球菌性尿道炎中，除衣原體外，解脲脲原體感染占第二位，有30～40%男性尿道炎是由解脲脲原體感染所致。解脲脲原體可形成繼發(fā)感染，在淋球菌尿道炎患者中解脲脲原體檢出率高于非淋球菌性尿道炎2.16倍，也是某些淋病患者治愈后仍有后遺癥因素之一。

大量研究證明解脲脲原體與自然流產(chǎn)、先天缺陷、死胎和不孕癥關于。自然流產(chǎn)1～8次婦女宮頸分泌物或流產(chǎn)胎兒組織解脲脲原體檢出率為68%，其中流產(chǎn)超過4次以上者檢出率高達80%，而正常婦女檢出率僅為10.5%。國內(nèi)對2181例不孕患者研究報道，解脲脲原體檢出率明顯高于對照組。陽性患者經(jīng)強力霉素治療后轉(zhuǎn)陰者為83.7%，其中恢復妊娠者為38.7%，闡明不孕癥與解脲脲原體感染高度有關。

解脲脲原體感染除引起男性非淋性尿道炎、前列腺炎、附睪炎外，還被以為與男性不育有關，男性不育患者精液中，脲原體檢出率高達66.6%。檢出率隨精子數(shù)減少和精子活動力下降而升高。

有研究證明解脲脲原體引起不孕癥因素也許是：①吸附于精子表面，阻礙精子運動；②產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶樣物質(zhì)，干擾卵子與精子結(jié)合；③解脲脲原體與精子有共同抗原，刺激機體產(chǎn)生抗體對精子導致?lián)p傷。二熒光探針定量PCR辦法檢測UU-DNA意義

對UU感染病原學診斷普通可用簡便培養(yǎng)法和免疫熒光抗體來檢測，但陽性率偏低，并且費時。培養(yǎng)法檢測是運用脲原體能合成尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，使液體培養(yǎng)基pH值增高，酚紅批示劑變色。某些非致病脲原體或培養(yǎng)過程中污染都也許導致假陽性成果。熒光探針定量PCR辦法通過直接檢測可疑患者生殖道分泌物或尿液中UU-DNA，具備高度敏感性和特異性，提高了陽陽性檢出率。

病原體診斷只是為臨床提供某種根據(jù)，而病原體感染后發(fā)病時間和病情輕重均與病原體數(shù)量關于，這就規(guī)定定量成果。熒光探針定量PCR不但可以對病原體感染進行診斷，還可以通過檢測用藥先后病人UU-DNA拷貝數(shù)變化監(jiān)控病情發(fā)展。有報道顯示，對解脲脲原體感染患者治療2w后復查，陽性患者UU-DNA水平拷貝數(shù)有明顯下降，其轉(zhuǎn)陰率為44.7%，治療3w后復查，則轉(zhuǎn)陰率達76%，提示UU對當前臨床慣用于治療性病抗生素有一定耐藥性，應持續(xù)治療3w以上。采用熒光探針定量PCR檢測UU-DNA，具備迅速、特異性高、定量精確等長處，避免盲目用藥，即減少病人痛苦，縮短病程，又減輕了病人經(jīng)濟承擔，可覺得臨床評價療效提供根據(jù)。沙眼衣原體(CT)

一沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis，CT)感染

沙眼衣原體嚴格寄生在細胞內(nèi)，具備獨特發(fā)育周期。不但可致眼部和肺部感染，也是性傳播疾病重要病原體。近年來在歐美等國，沙眼衣原體感染率和危害性，已超過淋球菌而居性傳播疾病之首。在國內(nèi)，在非淋球菌性尿道炎中，沙眼衣原體感染居首位。

沙眼衣原體侵入機體后重要在粘膜上皮細胞內(nèi)繁殖，且抑制宿主細胞代謝。衣原體在繁殖過程中產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物可引起細胞毒性反映及變態(tài)反映，導致病理損傷。

沙眼衣原體感染后機體免疫反映不強，維持時間短，易形成隱匿性感染，往往可重復感染。所引起泌尿生殖系感染對男性來說重要是尿道炎，未經(jīng)治療男性患者多數(shù)轉(zhuǎn)變成慢性感染，周期性加重，或合并附睪炎和前列腺炎。在女性，可引起尿道炎、宮頸炎、嚴重者可并發(fā)輸卵管炎及盆腔炎，妨礙妊娠并可導致生殖能力損害。圍產(chǎn)期母兒傳播可致新生兒肺炎，沙眼衣原體母兒傳播率高達30%—70%。

CT引起泌尿生殖道感染常合并淋球菌混合感染，淋球菌對衣原體繁殖有激活和刺激作用。二沙眼衣原體檢測辦法學討論及熒光探針PCR檢測CT-DNA意義

當前沙眼衣原體診斷由于受經(jīng)濟等因素影響限制，大某些醫(yī)院實驗室多采用金標法或ELISA法檢測沙眼衣原體相應抗體，雖然具備迅速簡便和較好特異性，但它事實上檢測是人體對沙眼衣原體免疫反映狀態(tài)。免疫學檢測有個“窗口期”時間，此外，抗體檢測不能鑒定是現(xiàn)癥感染還是既往感染。如CT-IgM陽性，但不能擬定CT在人體內(nèi)一定存在，如CT-IgM陰性，也不能排除CT

感染。

而熒光探針定量PCR能真實地反映CT存在和繁殖狀況，更重要是可提高標本中CT檢測率。從理論上講，只要標本中有一種病原體存在，熒光探針定量PCR就可以檢測到，普通實驗室也能檢出10個CT-DNA基因拷貝。

有臨床資料顯示，熒光探針定量PCR檢測疑似沙眼衣原體感染男性尿道炎患者尿道分泌物，沙眼衣原體陽性率為25%，女性宮頸炎患者宮頸分泌物沙眼衣原體陽性率高達40%，平均拷貝數(shù)達105數(shù)量級。熒光探針定量PCR提高了CT陽性檢出率，實現(xiàn)了CT迅速、初期和特異（其特異性可達100%）診斷，同步又可作為療效觀測可靠指標。單純皰疹病毒(HSV)

一單純皰疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）感染

單純皰疹病毒是皰疹病毒典型代表，由于在感染急性期發(fā)生水皰性皮疹即所謂單純皰疹而得名。本病毒以引起各種類型感染和疾病而日益受到注重。

HSV感染80～90%為隱性感染，大多無臨床癥狀或呈亞臨床體現(xiàn)，顯性感染只占少數(shù)，最常用是黏膜或皮膚局部浮現(xiàn)皰疹。HSV-I感染重要引起口唇皰疹，皰疹性結(jié)膜炎、腦炎和皮膚性皰疹，6個月～2歲嬰幼兒容易發(fā)生HSV-I原發(fā)感染。HSV-II重要引起生殖器皰疹，原發(fā)性生殖器皰疹中80%由HSV-II引起，少數(shù)由HSV-I所致，可通過性行為傳播。

人體HSV原發(fā)感染后不久產(chǎn)生特異性免疫，能將大某些病毒清除，但少數(shù)病毒可長期存留于神經(jīng)細胞內(nèi)，病毒在細胞內(nèi)并不大量增殖破壞細胞，此時稱為潛伏感染。只有當人體受到各種非特異刺激，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、日曬、月經(jīng)來潮、情緒緊張或在某些細菌、病毒感染或用腎上腺皮質(zhì)等影響下，病毒基因被激活，病毒又重新沿著神經(jīng)纖維軸突移行至神經(jīng)末稍支配上皮細胞內(nèi)增殖，再次產(chǎn)生皰疹，稱為復發(fā)。HSV復發(fā)往往在同一部位。

HSV原發(fā)感染后1w左右，血中浮現(xiàn)中和抗體，3～4w達高峰，可持續(xù)近年。這些抗體可中和游離病毒，制止病毒在體內(nèi)擴散，但不能消除潛伏于神經(jīng)節(jié)中病毒和制止復發(fā)。

妊娠期婦女因HSV-I原發(fā)感染或潛伏感染病毒被激活，HSV可通過胎盤感染胎兒，可引起胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)等。分娩時胎兒通過有HSV感染產(chǎn)道也可感染而發(fā)生新生兒皰疹。新生兒皰疹多發(fā)生在頭皮等暴露部位，嚴重時累及內(nèi)臟，死亡率高達50%以上。

人們通過廣泛研究和實驗，以為HSV-II感染與子宮頸癌發(fā)生有密切關系。患過生殖器皰疹婦女，宮頸癌發(fā)病率高，且好發(fā)部位相似，都在鱗狀上皮和柱狀上皮交界處；宮頸癌患者HSV-II抗體陽性率和效價均高；分子雜交實驗證明宮頸癌細胞中有HSV-II基因片段并有特異性mRNA存在。

HSV常與HIV-I同步感染，并能增進病情發(fā)展，引起嚴重局部和播散性感染。當前以為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復制。二熒光探針定量PCR技術檢測HSV-DNA意義

（一）雖然分離培養(yǎng)法是檢測HSV金標法，但其有費時、繁瑣缺陷。臨床上慣用ELISA和間接免疫熒光法(IFA)來檢測HSV特異性抗體，但在在疾病初期（即病毒“窗口期”），血液中不易檢測到病毒抗體，此時，宜首選熒光探針定量PCR法進行檢測。研究證明，在生殖器潰瘍愈合過程中，熒光探針定量PCR檢測無癥狀排毒更為敏感。因而，對于皰疹已結(jié)痂者，或無痂狀排毒患者，用熒光探針定量PCR法檢測單純皰疹病毒可作為首選辦法。

（二）對處在育齡期女性患者來說，HSV感染應引起高度注重，以免因HSV感染而導致胎兒畸形也許性發(fā)生。由于HSV感染與宮頸癌關系密切，曾經(jīng)感染或已經(jīng)感染有生殖器皰疹婦女，應特別警惕生殖器皰疹感染引起宮頸癌變。因而，熒光探針定量PCR檢測對初期篩查HSV感染、防止宮頸癌發(fā)生有十分重要意義。

（三）對臨床上由HSV-I型或HSV-II型感染所致皰疹性角膜炎、咽炎、腦膜炎、生殖器各類皰疹、宮頸癌、先天性及新生兒感染、胎兒畸形等各種疾病，特異、敏感、迅速、以便PCR技術對其原發(fā)感染或潛伏感染，可先于免疫學抗體浮現(xiàn)前做出HSV感染初期診斷。

（四）可以用于分型，通用型可以檢測HSV-I或HSV-II感染，HSV-II檢測單獨HSV-II引起感染。

（五）可以用于考核療效與預后，并可進行HSV分子病毒學及流行病學研究。HSV感染經(jīng)治愈后，其熒光探針PCR法檢測HSV-DNA呈陰性，而這時抗體檢測仍可為陽性成果。

梅毒螺旋體(TP)

一梅毒螺旋體感染

梅毒螺旋體又稱蒼白螺(Treponemapallidum，TP)又稱蒼白螺旋體，是引起人類梅毒病原體，屬于性傳播疾病中較危害一種。

國內(nèi)現(xiàn)階段，梅毒發(fā)病率呈逐漸上升趨勢.

在自然狀況下，梅毒螺旋體只感染人類，人是梅毒惟一傳染源。梅毒可分為后天性和先天性兩種，前者通過性接觸傳染，后者從母體通過胎盤傳染給胎兒。

后天性病毒要分為三期，體現(xiàn)為重復、潛伏和再發(fā)現(xiàn)象。

第一期梅毒：梅毒螺旋體經(jīng)外生殖器皮膚粘膜感染，約在感染后3w左右局部浮現(xiàn)無痛性硬性下疳，其潰瘍滲出物中含大量梅毒螺旋體，傳染性極強。約1個月，下疳常自然愈合。梅毒螺旋體進入血液中，經(jīng)2～3個月無癥狀潛伏期后進入第二期。

第二期梅毒：全身皮膚粘膜浮現(xiàn)梅毒疹，周身淋巴結(jié)腫大。在梅毒疹和淋巴結(jié)中，有大量梅毒螺旋體，如不治療，普通3周～3個月后體征可消退。

從硬性下疳至梅毒疹消失后一年，這段時間稱初期梅毒（即一、二期梅毒），此期傳染性強，但是破壞性小。

第三期梅毒：亦稱晚期梅毒。此期不但浮現(xiàn)皮膚粘膜潰瘍性壞死病灶，并侵犯內(nèi)臟器官或組織，嚴重者10～后，引起心血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。此期病灶中不易找到梅毒螺旋體，傳染性小、病程長，但破壞性大，可危及生命。

先天性梅毒是梅毒孕婦患者梅毒螺旋體通過胎盤進胎兒血流，并擴散至肝、脾、腎上腺等內(nèi)臟中大量繁殖，引起胎兒全身性感染，導致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎；或出生活梅毒兒，呈現(xiàn)鋸齒形牙、間質(zhì)性角膜炎、先天性耳聾等癥狀。

在感染所有階段，梅毒患者都能產(chǎn)生兩類抗體。一類是抗梅毒螺旋體抗體，在補體存在時，可通過ADCC作用而將梅毒螺旋體殺死或溶解。另一類是抗心磷脂抗體，稱為反映素(regain)，能與生物組織中脂質(zhì)發(fā)生反映。反映素無保護作用，僅可用于梅毒血清學診斷。

梅毒螺旋體抵抗力極弱，對溫度和干燥特別別敏感。血液中4℃放置3d可死亡，故血庫4℃冰箱儲存3d以上血液無傳染梅毒危險。

二梅毒螺旋體檢測辦法學討論和熒光探針定量PCR檢測TP-DNA意義

（一）顯微鏡檢查：從下疳滲出液、梅毒疹滲出液或局部淋巴結(jié)抽出液中直接用暗視野顯微鏡觀測運動活潑梅毒螺旋體；活體組織檢查慣用鍍銀染色法，但易與類似梅毒螺旋體其她物質(zhì)易混淆。適應于初期梅毒論斷，陽性成果可確診，但是此法檢出率低，陰性成果不能排除患病也許。

（二）非梅毒螺旋體抗原血清實驗：涉及性病研究實驗室實驗（VDRL）、不加熱血清反映素實驗（USR）、迅速血漿反映素環(huán)狀卡片實驗（RPR）和甲苯胺紅不加熱血清反映素實驗（TRUST）。當前，國內(nèi)大多數(shù)實驗室采用是USR和RPR，作為梅毒診斷常規(guī)實驗和大量人群初篩實驗。此類辦法原理是采用正常牛心脂質(zhì)作為抗原，測定清中反映素（抗脂質(zhì)抗體）。由于其抗原為非特異性，某些非梅毒疾病如高脂血癥、紅斑性狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、孕婦等均可浮現(xiàn)假陽性。當抗體含量過高時，易浮現(xiàn)假陰性反映，即前帶現(xiàn)象。

（三）梅毒螺旋體抗原血清實驗：1.熒光密螺旋體抗體吸取實驗（FTA-ABS），本法為間接免疫熒光法，特異性強，敏感性也高，特別適應于初期梅毒診斷。但該法操作繁瑣，需使用熒光顯微鏡，且病人經(jīng)藥物治療后，仍持續(xù)數(shù)年甚至終身浮現(xiàn)陽性反映，故不適當用于療效監(jiān)測。2.梅毒螺旋體血球凝集實驗（TPHA），是一種間接凝集實驗，檢測血清中特異性梅毒螺旋體抗體，其效價在1:80以上為陽性，日當前國內(nèi)許多醫(yī)院慣用梅毒血清確認實驗。TPHA敏感性和特異性較高，缺陷是試劑成本較高，操作較麻煩，且易發(fā)生自凝現(xiàn)象和假陽性。3.梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附實驗（TP-ELISA），簡便易行，但同樣存在病人經(jīng)藥物治療后，抗體仍持續(xù)數(shù)年甚至終身浮現(xiàn)陽性反映，故不適當用于療效監(jiān)測。

（四）梅毒螺旋體不能進行體外培養(yǎng)。檢測臨床標本中梅毒螺旋體最敏感、可靠辦法是兔感染實驗（RIT），RIT能證明活梅毒螺旋體存在，是檢測梅毒螺旋全慣用原則辦法，然而由于操作繁瑣，該辦法并不能作為臨床檢測中常規(guī)診斷辦法。

（五）熒光探針定量PCR檢測TP-DNA意義

1．熒光探針PCR直接檢測梅毒螺旋體DNA，其敏感性、特異性均優(yōu)于血清學辦法（理論上，PCR檢測梅毒螺旋體敏感性和家兔感染實驗相似），是當前診斷梅毒螺旋體先進辦法。

2.針對梅毒不同步期存在和繁殖不同部位，采用相應標本，局某些泌物（一期）、皮疹/淋巴結(jié)穿刺液（二期）、潰瘍部位刮片（三期）、血液（各期），可以迅速精確診斷梅毒螺旋體感染。因梅毒螺旋體?？梢鹬袠猩窠?jīng)系統(tǒng)病變，而初期常不體現(xiàn)出臨床癥狀，因而，腦脊液標本PCR檢測，有助于迅速精確地診斷神經(jīng)性梅毒。梅毒孕婦患者羊水亦可檢測到TP-DNA存在，這對于防止新生兒先天性梅毒感染，有著積極意義。

3.對新生兒梅毒螺旋體感染高危人群，血清學實驗無法將無癥狀感染嬰兒同非感染嬰兒區(qū)別開來，由于媽媽IgG可傳遞給胎兒，在此種狀況下，PCR檢測血液或腦脊液是確診梅毒螺旋體感染最佳辦法。

4.梅毒并不是個非?？膳录膊。强梢愿?，核心在于初期診斷和初期治療，由于梅毒在一期、二期時候，有一定隱匿性，容易導致漏診和誤診。對于初期梅毒，熒光探針定量PCR檢測TP-DNA比血清學辦法要敏感得多。此外由于IgG終身存在，因此很難評價治療效果，熒光探針定量PCR檢測為考核療效提供了最客觀根據(jù)。人類免疫缺陷病毒（HIV）1.艾滋病病毒感染

艾滋病病毒簡稱HIV，是一種能襲擊人體免疫系統(tǒng)病毒。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要T4淋巴細胞作為襲擊目的，大量吞噬、破壞T4淋巴細胞，從而破壞人免疫系統(tǒng)，最后使免疫系統(tǒng)崩潰，使人體因喪失對各種疾病抵抗能力而發(fā)病并死亡。

病毒廣泛存在于感染者血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經(jīng)癥狀腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高，感染者潛伏期長，死亡率高。

現(xiàn)已證明HIV是嗜T4淋巴細胞和嗜神經(jīng)細胞病毒。HIV由皮膚破口或粘膜進入人體血液，重要襲擊和破壞靶細胞T4淋巴細胞（T4淋巴細胞在細胞免疫系統(tǒng)中起著中心調(diào)節(jié)作用，它能增進B細胞產(chǎn)生抗體），便得T4細胞失去原有正常免疫功能。當激活免疫反映T4細胞幾乎所有被HIV消除，T4細胞抑制細胞在數(shù)量上巨增，相反病人體內(nèi)T4細胞在數(shù)量上驟減，從而導致病人免疫功能所有衰竭，為條件性感染創(chuàng)造了極為有利條件。

HIV對神經(jīng)細胞有親合力，能侵犯神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦組織破壞，或者繼發(fā)條件性感染而致各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。

HIV和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒同樣，當逆轉(zhuǎn)錄酶使病毒RNA作為模板合成DNA而成前病毒DNA整合到宿主細胞DNA中時，HIV帶有致癌基因可使細胞發(fā)生癌性轉(zhuǎn)化，特別是在細胞免疫遭到破壞，喪失免疫監(jiān)視作用狀況下，細胞癌變更易發(fā)生。2.艾滋病毒檢測辦法學討論及熒光探針PCR檢測HIV-DNA意義

當前檢測HIV辦法有100各種，總體來說可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。病毒檢測涉及細胞培養(yǎng)(病毒分離)、p24抗原檢測和病毒核酸檢測。細胞培養(yǎng)辦法檢測HIV專一性強，不會浮現(xiàn)假陽性，對于確認那些抗原/抗體檢測不擬定個體和陽性媽媽新生兒與否感染HIV有著重要意義。但是須要有一定數(shù)量感染細胞存在才干培養(yǎng)和分離出病毒來，因而敏感性差、操作時間長、操作復雜，必要在特定P3實驗室中才干進行，且費用較高（每次培養(yǎng)需要約200～500美元），不合用于臨床。p24抗原檢測可以在病毒開始復制后檢測到血液中可溶性p24抗原，但易浮現(xiàn)假陽性。因而，陽性成果必要經(jīng)中和實驗確認，該成果才可作為HIV感染輔助診斷根據(jù)。HIV1p24抗原檢測陰性，只表達在本實驗中無反映，不能排除HIV感染。

病毒核酸檢測普通是通過檢測HIVRNA水平來反映病毒載量，具備很高敏捷度，使用適時熒光聚合酶鏈反映(PCR)技術，可以在HIV感染前2周檢測到病毒核酸。病毒核酸檢測辦法可用于HIV初期診斷，如窗口期輔助診斷、病程監(jiān)控、指引治療方案及療效測定、預測疾病進程等。當前慣用測定辦法有逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗(RT-PCR)、核酸序列擴增實驗(NASBA)、分支DNA雜交實驗(bDNA)等。使用高敏捷度適時熒光PCR技術，可以在HIV感染前2周檢測到病毒核酸，減少病人痛苦，縮短病程，減輕病人經(jīng)濟承擔，可覺得臨床評價治療提供根據(jù)。人乳頭瘤病毒(HPV)

一人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染

人乳頭瘤病毒屬于DNA腫瘤病毒，具備宿主和組織特異性，只能感染人皮膚和黏膜上皮細胞，導致不同限度增生性病變，人類是HPV惟一自然宿主。

當前HPV尚不能在組織細胞中培養(yǎng)。HPV增殖復制與上皮細胞分化階段有關，完整HPV病毒體僅在終未分化角質(zhì)層細胞中產(chǎn)生，分化成熟角質(zhì)層細胞不久脫落，故HPV抗原接觸免疫系統(tǒng)機會較少，這也是導致HPV免疫原性低，易形成持續(xù)感染重要因素之一。

HPV傳播重要通過直接接觸感染者病損部位或間接接觸被病毒污染物品。生殖器感染重要由性接觸傳播，新生兒可在通過產(chǎn)道時受感染。HPV病毒感染僅停留于局部皮膚和黏膜中，不產(chǎn)生病毒血癥。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HPV有100各種型，不同型HPV侵犯部位和所致疾病也不相似。其中HPV6、11型可引起尖銳濕疣、喉乳頭瘤等良性病變，稱為低危型HPV，而HPV16、18、33等型別與宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤等惡性腫瘤發(fā)生關于，稱高危型HPV。

宮頸癌是女性最常用惡性腫瘤之一，也是當前唯一發(fā)病因素清晰腫瘤，HPV感染是宮頸癌重要致病因素之一，依照美國癌癥記錄學資料，全美約有12900例新發(fā)病人，死亡約4400例。國內(nèi)每年新發(fā)宮頸癌病例約計13萬，占全世界宮頸癌新發(fā)病例28%。因而，宮頸癌病因與其發(fā)病機制研究受到國內(nèi)外學者高度注重。宮頸癌致病因素是很復雜，是各種因素作用成果。許多研究表白，HPV是宮頸癌致癌重要因素，但HPV感染并非唯一致癌因素，HSV以及HCMV等也與宮頸癌存在密切關系。二熒光探針PCR檢HPV-DNA意義

（一）高危型HPV感染與宮頸癌關系密切，98%宮頸癌患者可以檢出HPV。常規(guī)組織學與細胞學辦法只能對臨床和病理體現(xiàn)典型病例做出診斷，新發(fā)展薄層液基細胞學檢測技術采用超薄涂片技術，背景干凈清晰，有助于明確診斷，但這歸根結(jié)底是從細胞學水平來觀測細胞形態(tài)學變化，其中80%患者確診時已是宮頸癌晚期。

（二）熒光探針定量PCR辦法直接檢測HPV-DNA，比核酸分子雜交技術更具敏感性、特異性，迅速、精確。該辦法簡便，能達到較為抱負成果，大大提高了HPV檢測水平，是宮頸癌防止、診治突破性進展。

（三）熒光探針定量PCR可以精確判斷體內(nèi)HPV感染，不但可以對組織病理變化典型病例做出診斷，對不典型鱗狀上皮細胞增生患者同樣可以做出診斷，同步還可以對亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。HPV-DNA是美國FDA規(guī)定婦女宮頸癌篩查必檢項目。

（四）可對其進行分型（高危型HPV16、18型和低危型HPV6、11型）。

（五）可以預計病毒載量與患癌癥風險，有報道顯示，持續(xù)性HPV-DNA高病毒載量婦女患宮頸癌有關風險是HPV-DNA陰性婦女30倍。

（六）可以考核療效與預后。HPV-DNA載量下降水平或消失可以判斷治療與否有效，其DNA水平高低也是預計預后一種重要指標。

感染性疾病熒光探針定量PCR檢測和診斷，其辦法學根據(jù)是基于直接檢測和擴增病原體遺傳物質(zhì)核酸(DNA或RNA)，是“現(xiàn)癥感染”最直接和最客觀根據(jù)，這也是它與免疫學辦法主線區(qū)別，因此標本對的留取尤為重要，一定要對病原體感染和存在相應部位進行對的取材，才干提高檢測陽性率和精確率。

例如肺部結(jié)核桿菌感染，一定要取深部痰液或肺泡灌洗液。如果只是簡樸地取咽拭子，其陽性率就會大大減少。血液標本結(jié)核桿菌陽性，只有在結(jié)核桿菌擴散入血，形成播散性結(jié)核時才會浮現(xiàn)。核酸種類

病原體

檢測標本

DNA類

乙型肝炎病毒（HBV）

血清、血漿等

DNA類

結(jié)核桿菌（TB）

深部痰液、肺炎支氣管炎灌洗

液、腦脊液、尿液、血液等DNA類

淋球菌（NGH）

生殖、泌尿道分泌物DNA類

沙眼衣原體（CT）

生殖、泌尿道系統(tǒng)DNA類

解脲脲原體（UU）

生殖、泌尿道系統(tǒng)DNA類

人乳頭瘤病毒6，11型（HPV6，11）

生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片、組織活檢標本等

DNA類

人乳頭瘤病毒16，18

型（HPV16，18）

生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片、組織活檢標本等

DNA類

單純皰疹病毒通用型（HSV）

生殖泌尿道分泌物、尿道口或患病某些刮片、皰診液等

DNA類

單純皰疹病毒II型（HSV）

生殖泌尿道分泌物、尿道口或患病某些刮片、皰診液等

DNA類

弓形蟲（TOX）

全血、羊水、絨毛膜等

DNA類

巨細胞病毒（HCMV）尿液、乳汁、血清或全血等

DNA類

梅毒螺旋體（TP）

梅毒疹、潰瘍部位等刺液或刮片、血液、腦脊液等

DNA類

幽門螺旋菌（HP）

胃液