豬傳染性胃腸炎病毒全基因組克隆及N蛋白的表達的開題報告

豬傳染性胃腸炎病毒全基因組克隆及N蛋白的表達的開題報告一、選題背景及意義豬傳染性胃腸炎（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是一種由豬傳染性胃腸炎病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的急性胃腸炎。病毒于20世紀(jì)70年代從歐洲傳入美國，后在亞洲和歐洲廣泛傳播，導(dǎo)致豬類生產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。病毒對幼年豬特別致命，死亡率可以高達100%。雖然PEDV在已有的病毒大流行中比較常見，但是新出現(xiàn)的PEDV亞型依然很容易造成嚴(yán)重的經(jīng)濟后果。因此研究PEDV成為當(dāng)前豬類養(yǎng)殖的熱點問題。PEDV是一種單股正鏈RNA病毒，屬于科學(xué)家們稱之為冠狀病毒的這一病毒家族。PEDV的基因組大約有28kb，含有6個讀碼框（ORF）。其病毒顆粒大小在60~140nm之間，具有表面的突起結(jié)構(gòu)。盡管PEDV的基本生物學(xué)和分子特征已被廣泛研究，但對其致病機制和免疫防御機制的理解仍然不足?；谏鲜鲈?，本項目旨在利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建PEDV全基因組的克隆體，并進一步表達其N蛋白。該研究可為深入研究PEDV的生物學(xué)和分子機制提供必要的工具和基礎(chǔ)。二、研究目的本研究旨在將PEDV全基因組進行克隆，并通過表達其N蛋白，進一步了解PEDV的致病機制和免疫防御機制。三、研究內(nèi)容本研究共包括以下三個方面的內(nèi)容：1.PEDV全基因組的克隆采用RT-PCR和RACE技術(shù)構(gòu)建PEDV全基因組的克隆即包括6個ORF的cDNA子庫。相關(guān)的反向和正向引物將分別設(shè)計以擴增比較全長的病毒基因組。隨后，利用pMD19T-Vecter系統(tǒng)獲得目標(biāo)基因插入質(zhì)粒，并得到獲得目標(biāo)基因插入質(zhì)粒的表達菌株。2.PEDV全基因組的序列分析獲得PEDV全基因組cDNA之后，通過雙向測序，利用序列編輯軟件進行序列拼接，獲得PEDV全基因組序列。隨后，將所獲得的PEDV全基因組序列與NCBI中病毒序列數(shù)據(jù)庫進行比對，并進行序列分析。3.PEDVN蛋白的表達利用基因工程技術(shù)，將PEDV的N蛋白的蛋白質(zhì)表達載體構(gòu)建完成，并利用轉(zhuǎn)染技術(shù)表達其蛋白。通過蛋白分離和鑒定分析檢測表達情況，并采用免疫印跡等方法進行檢測。四、擬解決的問題該研究擬解決PEDV的全基因組的克隆以及其N蛋白的表達問題，通過研究了解PEDV的致病機制和防御機制。并提高人們對PEDV的認識，為今后研究此病毒提供一定的基礎(chǔ)。五、研究預(yù)期成果1.成功克隆PEDV全基因組，并對其進行序列分析，從而更深入地了解PEDV的生物學(xué)與分子特征。2.成功表達PEDV的N蛋白，并對其進行鑒定和檢測。為進一步研究PEDV的致病機制和防御機制提供必要的實驗基礎(chǔ)。3.本研究成果還將為PEDV的防治提供科學(xué)依據(jù)，為豬類生產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展做出貢獻。六、研究方法1.病毒菌株的分離與提取RNA收集病毒，并利用RNA提取試劑盒提取病毒的RNA。2.RT-PCR擴增利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴增PEDV基因組的cDNA。3.6個ORF的插入質(zhì)粒的構(gòu)建將所擴增的PEDV基因組的cDNA通過pMD19-Tvector轉(zhuǎn)化至E.coli中，得到3個插入質(zhì)粒。4.雙向測序及序列分析使用Sanger測序技術(shù)進行PEDV全基因組序列的雙向測序，利用序列編輯軟件進行序列拼接和分析。5.PEDVN蛋白表達載體的構(gòu)建將所克隆的PEDV的N蛋白接向pET28a(+)載體進行重組，獲得表達載體。6.經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的N蛋白表達將表達載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)E.coli并經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達PEDV的N蛋白，獲得表達產(chǎn)物。7.蛋白印跡檢測通過免疫印跡等方法測定PEDVN蛋白的表達情況。七、進度安排本研究擬申請2年時間進行，進度安排如下：第一年：1.病毒菌株的分離和RNA提取。2.PEDV全基因組的克隆。3.PEDV全基因組的測序和序列分析。第二年：1.構(gòu)建PEDVN蛋白表達載體。2.PEDVN蛋白的表達和檢測。3.數(shù)據(jù)分析和總結(jié)。八、參考文獻1.李玲玲,尹建慶.豬流行性腹瀉病毒研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,3(40):7-12.2.Song,D.,&Park,B.(2012).Porcineepidemicdiarrhoeavirus:acomprehensivereviewofmolecularepidemiology,diagn