牙膏中耐熱大腸菌群檢驗方法

附件13牙膏中耐熱大腸菌群檢驗方法DetectionofThermotolerantColiformBacteriainToothpaste1范圍本規(guī)范規(guī)定了牙膏中耐熱大腸菌群的檢驗方法。本規(guī)范適用于牙膏中耐熱大腸菌群的檢驗。2定義2.1耐熱大腸菌群Thermotolerantcoliformbacteria系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃培養(yǎng)24h～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌主要來自人和溫血動物糞便，可作為糞便污染指標來評價牙膏的衛(wèi)生質(zhì)量,推斷牙膏中有否污染腸道致病菌的可能。3儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44.5℃±0.5℃。3.2溫度計。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環(huán)。3.6電磁爐。3.7三角瓶：250mL。3.8試管：18mm×150mm。3.9小倒管。3.10pH計或pH試紙。3.11高壓滅菌器。3.12無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸頭。3.13滅菌平皿：直徑90mm。4培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見總則3.1。4.2雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫8014g蒸餾水1000mL制法：將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào)pH為7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管，每管10mL（每支試管中加一個小倒管）。115℃高壓滅菌20min。4.3伊紅美藍（EMB）瓊脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL0.5%美藍水溶液13mL蒸餾水1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀和蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至1000mL。調(diào)pH值為7.2~7.4，分裝于三角瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中無菌操作加入5mL滅菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊紅水溶液和1.3mL0.5%美藍水溶液，搖勻，冷至45℃~50℃，傾注平皿備用。4.4蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：將上述成分加熱融化，調(diào)pH值為7.0~7.2，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。4.5靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗方法：接種細菌于蛋白胨水中，于44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL~0.5mL，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。4.6革蘭氏染色液：4.6.1染液制備4.6.1.1結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。4.6.1.2革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。4.6.1.3脫色液：95%乙醇。4.6.1.4復染液：（1）沙黃復染液：沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。（2）稀石碳酸復紅液：稱取堿性復紅10g，研細，加95%乙醇100mL，放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復紅液。再取此液10mL加水90mL，即為稀石碳酸復紅液。4.6.2染色法4.6.2.1將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。4.6.2.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。4.6.2.3滴加95%乙醇脫色，約30s，或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s，水洗。4.6.2.4滴加復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。4.6.3染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1:10稀釋石碳酸復紅染色液作復染，復染時間僅需10s。5操作步驟5.1取10mL1:10的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，如既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。5.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時取該培養(yǎng)液1~2滴接種到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或粉紫色、中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應(yīng)注意挑選。5.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性反應(yīng)液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。