類風(fēng)濕診斷與抗抗體檢測(cè)

類風(fēng)濕診斷與抗抗體檢測(cè)第1頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月概述類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種自身免疫性疾病。由于一方面自身免疫的病理機(jī)制決定了這類疾病的疑難和復(fù)雜；另一方面由于這類疾病累及多個(gè)系統(tǒng)和器官，臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜。所以RA以往在臨床上更多的表現(xiàn)為“疑難雜癥”。風(fēng)濕性疾病的現(xiàn)狀可以概括為“四多”，累及臟器多；起病首發(fā)表現(xiàn)多；誤診誤治多；致殘多。從而也引發(fā)出另外一多“病人花費(fèi)多”！由于風(fēng)濕性疾病早期表現(xiàn)不典型，有些疾病有兩種或兩種以上表現(xiàn)相互重疊；同時(shí)，風(fēng)濕性疾病存在相互轉(zhuǎn)化的情形；所以風(fēng)濕性疾病的早期診斷有一定的困難。因此，對(duì)風(fēng)濕性疾病患者的隨訪和定期檢查顯得尤為重要，這也是驗(yàn)證我們?cè)缙诘脑\斷是否正確的必由之路。正確的早期診斷是采取規(guī)范化治療、提高患者的生活質(zhì)量、改善預(yù)后的前提。第2頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1987分類標(biāo)準(zhǔn)①晨僵;②3個(gè)或3個(gè)以上關(guān)節(jié)腫脹（軟組織）;③手關(guān)節(jié)腫脹（近端指間關(guān)節(jié)，掌指關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)）;④對(duì)稱性腫脹（軟組織）;⑤皮下結(jié)節(jié);⑥血清類風(fēng)濕因子陽性;⑦骨關(guān)節(jié)X線片示手或腕關(guān)節(jié)侵蝕性缺損和（或）關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)疏松。以上1～4項(xiàng)必須為醫(yī)師所見，持續(xù)6周或以上，具備上列7項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的4項(xiàng)，即可診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。第3頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月ACR和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）2009年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分系統(tǒng)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷和早期治療已成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎迫切需要，以往的分類標(biāo)準(zhǔn)不能達(dá)到早期診斷的目的，分類標(biāo)準(zhǔn)不等于診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床工作更需要一個(gè)可靠的疾病緩解標(biāo)準(zhǔn)（包括臨床緩解與結(jié)構(gòu)進(jìn)展等問題）。但實(shí)際上制定一個(gè)早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分類標(biāo)準(zhǔn)很困難，有人提出了炎性關(guān)節(jié)炎的概念，甚至提出了早期炎性關(guān)節(jié)炎的概念，正是因?yàn)檫@部分患者炎性關(guān)節(jié)炎不是全部，而是部分發(fā)展為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，在新的分類標(biāo)準(zhǔn)中如果判斷有可能發(fā)展為持續(xù)炎性關(guān)節(jié)炎或破壞性關(guān)節(jié)炎，這類關(guān)節(jié)炎就被認(rèn)為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。第4頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月2009年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分系統(tǒng)必要條件至少一個(gè)關(guān)節(jié)腫痛，并有滑膜炎的證據(jù)（臨床或超聲或磁共振成像）在未分化關(guān)節(jié)炎中需要排除其他疾病引起的關(guān)節(jié)炎癥狀和體征。第5頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月其他條件①血清學(xué)：抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）和類風(fēng)濕因子（RF）;②受累關(guān)節(jié)的種類（小或大關(guān)節(jié)）和數(shù)量;③滑膜炎的病程;④急性血象反應(yīng)：紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）。第6頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷診斷第一步滿足2項(xiàng)必要條件，并有常規(guī)典型放射學(xué)RA骨破壞的改變，可明確診斷為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，第7頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷診斷第二步如沒有常規(guī)典型放射學(xué)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的改變，需要進(jìn)入以下分類評(píng)分系統(tǒng)，請(qǐng)記住以下分值表中的得分。不同的關(guān)節(jié)受累情況再加上區(qū)域辨別條件中的任何項(xiàng)目，評(píng)分大于6分提示為確定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎第8頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月ACR和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）2009年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分系統(tǒng)受累關(guān)節(jié)數(shù)分值（0~5分）1

中大關(guān)節(jié)02~10

中大關(guān)節(jié)11~3

小關(guān)節(jié)24~10

小關(guān)節(jié)3>10

至少一個(gè)為小關(guān)節(jié)5血清學(xué)抗體檢測(cè)（0~3分）RF或抗CCP均陰性0RF或抗CCP至少一項(xiàng)低滴度陽性2RF或抗CCP至少一項(xiàng)高滴度陽性3滑膜炎持續(xù)時(shí)間（0~1分）<6周0≧6周1急性期反應(yīng)物（0~1分）CRP或ESR均正常0CRP或ESR增高16分或以上肯定RA診斷

第9頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷診斷第三步樹枝計(jì)算法，根據(jù)關(guān)節(jié)受累情況：①》10個(gè)關(guān)節(jié)（至少1個(gè)小關(guān)節(jié)）;②4～10個(gè)小關(guān)節(jié);③1～3個(gè)小關(guān)節(jié);④2～10個(gè)中大關(guān)節(jié);按圖2是或否繼續(xù)分類。樹枝計(jì)算法用文字描述：①如滿足受累關(guān)節(jié)大于10個(gè)關(guān)節(jié)（至少1個(gè)小關(guān)節(jié)）（5分）同時(shí)滿足血清學(xué)陽性（或滑膜炎病程≥6周，或ESR/CRP升高），評(píng)分≥6分;②如滿足4～10個(gè)小關(guān)節(jié)受累（3分）同時(shí)需要滿足血清學(xué)高滴度陽性，或血清學(xué)低滴度陽性+滑膜炎病程≥6周（或+ESR/CRP升高），評(píng)分≥6分;第10頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷③如滿足1～3個(gè)小關(guān)節(jié)受累（2分）同時(shí)需要滿足血清學(xué)高滴度陽性+滑膜炎病程≥6周（或+ESR/CRP升高），或血清學(xué)低滴度陽性+滑膜炎病程≥6周+ESR/CRP升高，評(píng)分≥6分;④如滿足2～10個(gè)中大關(guān)節(jié)受累（1分）同時(shí)需要滿足血清學(xué)高滴度陽性+滑膜炎病程≥6周+ESR/CRP升高，評(píng)分≥6分。所以只要滿足以上任何一種情況，即提示為確定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。第11頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)室檢查目前臨床上對(duì)于RA的疑似患者所采取的初步篩查實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段多為常規(guī)風(fēng)濕四項(xiàng)，為血沉檢測(cè)（ESR）、C反映蛋白檢測(cè)（CRP）、類風(fēng)濕因子檢測(cè)（RF）、抗“O”檢測(cè)（ASO）。ESR和CRP與RA的活動(dòng)性有關(guān)，其檢測(cè)結(jié)果受多因素的影響，故只作為病情活動(dòng)性的參考指標(biāo)；ASO是一項(xiàng)排除性指標(biāo)。這三項(xiàng)檢測(cè)對(duì)于RA疑似患者的早期診斷意義不大。RF是目前最為常用的RA診斷指標(biāo)，但目前常用的RF檢測(cè)多為檢測(cè)IgM型，而IgM-RF在RA診斷中的敏感性只有40～70%，特異性只有70%左右，同時(shí)尚可見于5%的正常老年人、其它自身免疫性疾病、肝炎、結(jié)核等疾病。RF陰性并不能排除RA的診斷，約30%的早期RA患者RF為陰性。所以單純依靠常規(guī)風(fēng)濕四項(xiàng)檢測(cè)對(duì)于RA作出早期診斷并指導(dǎo)臨床治療還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。第12頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)室檢查近年來形成了一些敏感性和特異性都非常高的RA診斷技術(shù)，如抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）檢測(cè)、抗角蛋白抗體（AKA）檢測(cè)、抗RA33/RA36抗體檢測(cè)、抗Sa抗體檢測(cè)、抗核周因子抗體檢測(cè)等。以上抗體中兩項(xiàng)同時(shí)陽性者RA的可能性高達(dá)91.3%。其中，抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體檢測(cè)對(duì)早期RA診斷的敏感性和特異性高，是目前最常用的早期診斷指標(biāo)。第13頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月抗CCP抗體的定義：一種自身抗體。是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異而敏感的早期診斷指標(biāo)，可鑒別侵蝕性、非侵蝕性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，陽性者通常出現(xiàn)或易發(fā)展為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）是環(huán)狀聚絲蛋白的多肽片段，是以IgG型為主的抗體，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴(yán)重。第14頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月研究簡(jiǎn)史

抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）ELISA法是1998年Schellkens等建立起來輔助診斷RA的檢測(cè)方法，該技術(shù)一出現(xiàn)，立即備受關(guān)注，現(xiàn)已有商品供應(yīng)。按照前絲集蛋白cDNA序列，人工合成可能具有抗原表位的9~19個(gè)氨基酸短肽，并經(jīng)胍氨酸化修飾，經(jīng)ELISA篩選出具有抗原性片段。第15頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測(cè)方法

現(xiàn)有ELISA法、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法、膠體金法目前國(guó)內(nèi)已有許多廠家有商品試劑盒供應(yīng)。第16頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月ELISA檢測(cè)原理應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中CCP水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入CCP抗原、生物素化的抗人CCP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CCP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。檢測(cè)范圍：

3.9ng/ml-250ng/ml

第17頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法原理利用抗原抗體特異性結(jié)合及酶底物L(fēng)uminol發(fā)光體系定量檢測(cè)CCP。

1．靈敏度：10U/ml

2．特異性：與1mg/ml的脂蛋白、25mg/ml的球蛋白、0.1mg/ml的血紅蛋白、0.1μg/ml的透明質(zhì)酸、2mg/ml的粘蛋白、0.05mg/ml的β2-微球蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。

3．精密度：批內(nèi)CV值小于10%、批間CV值小于15%。

4．線性范圍：0～160U/ml

第18頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月膠體金法原理采用膠體金免疫層析技術(shù)，以間接法檢測(cè)血清中的自身抗體。檢測(cè)結(jié)果：陰性、陽性第19頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)本的采集及保存1.

細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。2.

血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3.

血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000xg離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。第20頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月ELISA操作注意事項(xiàng)1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。2.

一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3.

請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4.

如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀釋倍數(shù)。5.

在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6.

底物請(qǐng)避光保存第21頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月臨床應(yīng)用1．敏感性和特異性：抗CCP抗體與RF具有相同的敏感性（抗CCP抗體：80％，RF：79％），但特異性更高（抗CCP抗體：96％，RF：63％）。2．可應(yīng)用于ＲＡ早期診斷：研究發(fā)現(xiàn)抗ＣＣＰ抗體與早期ＲＡ強(qiáng)相關(guān)，在79％的早期患者中可檢出抗CCP抗體，陽性預(yù)測(cè)值為84%。

3．區(qū)別RA和其它風(fēng)濕性疾病：ＳＬＥ(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和ＲＡ在早期,有時(shí)候都會(huì)出現(xiàn)小關(guān)節(jié)侵蝕性病變,研究發(fā)現(xiàn)抗ＣＣＰ抗體在區(qū)別早期ＲＡ和早期