利用關(guān)聯(lián)作圖解析紫斑牡丹重要性狀的等位遺傳變異

利用關(guān)聯(lián)作圖解析紫斑牡丹重要性狀的等位遺傳變異牡丹(Paeoniasect.Moutan)是中國傳統(tǒng)名花,具有重要的觀賞、藥用和油用價值。常規(guī)雜交育種手段雖培育了許多優(yōu)良牡丹新品種,但存在育種周期長,效率低等問題,且牡丹基因組雜合度高,大部分重要性狀是數(shù)量性狀使得牡丹育種工作進(jìn)展緩慢。分子標(biāo)記輔助選擇育種(Marker-assistedselection,MAS)是利用分子標(biāo)記與控制目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的特點,能夠快速準(zhǔn)確篩選優(yōu)勢基因型,提高育種效率,是現(xiàn)代牡丹育種的發(fā)展方向之一。為此,本研究以我國牡丹家族中重要成員紫斑牡丹(Paeoniarockii)栽培群體為材料,在利用牡丹轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的基礎(chǔ)上,通過利用關(guān)聯(lián)群體分析和雜交群體驗證,首次開展了紫斑牡丹關(guān)聯(lián)作圖研究,獲得了與牡丹重要性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記,并挖掘其優(yōu)異等位變異位點。主要研究結(jié)果如下：(1)SSR分子標(biāo)記開發(fā)是本研究工作開展的基礎(chǔ)。通過對牡丹轉(zhuǎn)錄組59275條Unigenes序列分析,從3787條Unigenes序列中鑒定出4373個EST-SSRs,平均每9.24kb含有一個SSR位點,其中二核苷酸重復(fù)(46.26%)是最豐富的類型,其次是三、六、四和五核苷酸重復(fù)；利用Primerpremier5.0設(shè)計引物,選擇合成了788對SSR引物,其中373對引物(47.3%)成功擴增,149對引物(39.9%)在雜交群體的雙親中具有多態(tài)性。隨機選取30對引物檢測36個牡丹樣本的多態(tài)性和芍藥屬9個種間個體的通用性,多態(tài)性信息含量范圍從0.36到0.85,平均為0.69；通用性檢測發(fā)現(xiàn),95.3%的EST-SSR標(biāo)記可在9個種中有效擴增。此外,利用30對標(biāo)記分析了56個芍藥屬樣本的親緣關(guān)系,Neighbor-Joining(NJ)聚類分析表明主要集群與已知的譜系樹一致。研究結(jié)果表明新開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記為開展牡丹分子標(biāo)記輔助育種提供了重要的遺傳資源。(2)關(guān)聯(lián)群體的選擇及評價是關(guān)聯(lián)分析的第一步,至關(guān)重要。本研究篩選了一個由462株紫斑牡丹個體組成的栽培群體,對其29個數(shù)量性狀進(jìn)行了統(tǒng)計分析顯示,不同基因型間表型變異差異極顯著(P<0.01),遺傳變異系數(shù)為9.52%-112.10%,且在群體中呈現(xiàn)出正態(tài)分布的規(guī)律,其中果實性狀平均遺傳變異最大(41.69%),其次為葉部性狀(24.17%),在不考慮花瓣數(shù)性狀的情況下,花部性狀平均遺傳變異最小(17.25%),相對比較穩(wěn)定；主成分分析表明表型變異在該群體內(nèi)均勻分布,無顯著的層次結(jié)構(gòu)。6個質(zhì)量性狀表型頻率分布,表明群體中質(zhì)量性狀變異類型豐富。上述結(jié)果表明,本研究群體表型變異豐富,具有代表性,是關(guān)聯(lián)分析研究的合適群體。(3)群體遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)評價是開展關(guān)聯(lián)作圖的前提。利用40對EST-SSR標(biāo)記對紫斑牡丹關(guān)聯(lián)群體的462株個體進(jìn)行了遺傳多樣性評價,共確定了183個等位位點,等位基因數(shù)范圍為2-10,平均等位基因數(shù)為4.5,顯示了該群體具有中等遺傳多樣性水平。采用三種方法分析群體結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,三種方法均將紫斑牡丹關(guān)聯(lián)群體劃分為3個亞群體(K=3)。(4)連鎖不平衡檢測發(fā)現(xiàn)紫斑牡丹關(guān)聯(lián)群體所用SSR標(biāo)記間連鎖不平衡水平較低,大部分標(biāo)記位點處于顯著的連鎖平衡狀態(tài)(r2<0.1；P<0.001)。利用混合線性模型進(jìn)行單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)：確定了37個SSR標(biāo)記與11個花部性狀組成的46個顯著關(guān)聯(lián),單標(biāo)記可解釋表型變異的2.68%-23.97%,平均解釋率為5.50%；確定了21個SSR標(biāo)記與6個葉部性狀組成的25個顯著關(guān)聯(lián),單標(biāo)記解釋變異率范圍為2.19%-7.15%,平均解釋率為5.38%；確定了28個SSR標(biāo)記與7個果實性狀組成的64個顯著關(guān)聯(lián),單標(biāo)記解釋變異率范圍為2.21%-29.62%,平均解釋率為7.56%。(5)在關(guān)聯(lián)群體和雜交群體兩個作圖群體中同時出現(xiàn)的顯著關(guān)聯(lián)組合共計13個,其中與花部、葉部和果實性狀有關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)分別有5、1和7個。在這兩個群體內(nèi),具有一致效應(yīng)的顯著關(guān)聯(lián)組合共計9個(4個正效應(yīng)和5個負(fù)效應(yīng)),獲得了與外瓣寬、外瓣形狀、花色、單果種子干重、單果種子數(shù)和單果種子鮮重顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記,并進(jìn)一步統(tǒng)計了顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記的優(yōu)勢等位位點信息。綜上所述,