高效液相色譜方法及應(yīng)用

關(guān)于高效液相色譜方法及應(yīng)用色譜分析法是分析化學(xué)中獲得廣泛應(yīng)用的一個(gè)重要分支，是一個(gè)具有強(qiáng)大生命力的分離分析技術(shù)。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。第2頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法的特點(diǎn)

一、與經(jīng)典液相色譜法比較

經(jīng)典液相（柱）色譜法使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長(zhǎng)玻璃柱管內(nèi)，流動(dòng)相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度緩慢，柱入口壓力低，僅有低柱效，分析時(shí)間冗長(zhǎng)。

高效液相色譜法使用了全多孔微粒固定相，裝填在小口徑、短不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過(guò)高壓輸液泵進(jìn)入高柱壓的色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)，擴(kuò)散速度大大加快，從而在短的分析時(shí)間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力。第3頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、與氣相色譜法比較

氣相色譜僅能測(cè)量在操作溫度下可氣化且不分解的物質(zhì)，而對(duì)高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、

第4頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

熱不穩(wěn)定物、離子型化合物及高聚物的分離及測(cè)量有困難，致使其應(yīng)用受到了很大的限制。

高效液相色譜法不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，適合分離生物大分子、離子型化合物、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜測(cè)量的約占20％；能用高效液相色譜測(cè)量的達(dá)到70％～80％。

三、高效液相色譜法的特點(diǎn)

1.分離效能高

2.選擇性高

3.檢測(cè)靈敏度高

4.分析速度快第5頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法的分類

按溶質(zhì)在兩相分離過(guò)程中的物理化學(xué)原理分類1.吸附色譜（AdsorptionChromatography）2.分配色譜（PartitionChromatography）3.離子色譜（IonChromatography）4.體積排阻色譜（SizeExclusionChromatography）5.鍵合相色譜法（bonded-phasechromatography）6.親和色譜（AffinityChromatography）第6頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天按分離過(guò)程物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較

吸附色譜分配色譜離子色譜體積排阻色譜親和色譜固定相

全多孔固體吸附劑

固定液載帶在固相基體上

高效微粒離子交換劑

具有不同孔徑的多孔性凝膠

多種不同性能的配位體鍵聯(lián)在固相基體上

流動(dòng)相

不同極性有機(jī)溶劑

不同極性有機(jī)溶劑和水

不同pH值的緩沖溶液

有機(jī)溶劑或一定pH值的緩沖溶液

不同pH值的緩沖溶液，可加入改性劑

分離原理

吸附與解吸

溶解與揮發(fā)

可逆性的離子交換

多孔凝膠的滲透或過(guò)濾

具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的可逆性離解

第7頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜儀簡(jiǎn)介

1.貯液瓶

2.高壓輸液泵

3.進(jìn)樣器

4.色譜柱

5.檢測(cè)器

6.記錄裝置第8頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天貯液罐(流動(dòng)相)一、流動(dòng)相脫氣

（1）吹氦脫氣法

（2）加熱回流法

（3）抽真空脫氣法

（4）超聲波脫氣法

（5）在線真空脫氣法第9頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天高壓輸液泵及梯度洗脫裝置

一、高壓輸液泵

高壓輸液泵可以分為以下兩類：1．恒流泵：可輸出恒定體積流量的流動(dòng)相。（1）注射式泵（又稱注射式螺桿泵）（2）往復(fù)型泵2．恒壓泵：恒壓泵又稱氣動(dòng)放大泵，是輸出恒定壓力的泵。

第10頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、梯度洗脫裝置

1．梯度洗脫（gradientelution）又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱為梯度洗脫。2．梯度洗脫特點(diǎn)：提高柱效以及改善檢測(cè)器的靈敏度。第11頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天進(jìn)樣裝置

液相色譜常用的進(jìn)樣方式有三種：直接注射進(jìn)樣、停流進(jìn)樣和高壓六通閥進(jìn)樣。直接注射進(jìn)樣的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，并可獲得較高的柱效，但這種方法不能承受高壓。停流進(jìn)樣是在高壓泵停止供液、體系壓力下降的情況下，將樣品直接加到柱頭。這種進(jìn)樣方式操作不方便，重現(xiàn)性差，僅在不得已時(shí)才使用。高壓六通閥進(jìn)樣的優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)樣量的可變范圍大、耐高壓、易于自動(dòng)化，但容易造成譜峰柱前擴(kuò)寬。第12頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天色譜柱

多用內(nèi)壁拋光的不銹鋼制成，內(nèi)徑2～6mm，直形柱柱長(zhǎng)l0～l00cm。

在需要增加柱長(zhǎng)時(shí)，可使用死體積小的連接管，把幾根直形柱串接起來(lái)。第13頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天檢測(cè)器

用于液相色譜中的檢測(cè)器，應(yīng)具有靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、響應(yīng)快、死體積小等特點(diǎn)，還應(yīng)該對(duì)溫度和流速的變化不敏感。

液相色譜法中有兩種基本類型的檢測(cè)器：

一類是選擇性檢測(cè)器，如紫外一可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器；

另一類是通用型檢測(cè)器，如示差折光檢測(cè)器。第14頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)紫外一可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器。

是一種應(yīng)用廣泛，靈敏度和測(cè)量精度都比較高約選擇性檢測(cè)器。

它的檢測(cè)原理基于被測(cè)組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外一可見(jiàn)光的選擇性吸收，被測(cè)組分濃度與吸光度的關(guān)系服從朗伯一比爾定律。

它適用于在紫外和可見(jiàn)區(qū)有吸收的樣品。

第15頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天

(2)示差折光檢測(cè)器。

示差折光檢測(cè)器是根據(jù)流動(dòng)相中出現(xiàn)組分時(shí)，流動(dòng)相折射率發(fā)生變化而設(shè)計(jì)的。

溶液的折射率等于流動(dòng)相折射率與其濃度的乘積，加上組分折射率與其濃度的乘積。

示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，凡具有與流動(dòng)相折射率不同的組分，均可檢測(cè)且操作簡(jiǎn)便，但這種檢測(cè)器靈敏度不高，對(duì)溫度十分敏感，不能做梯度淋洗。

第16頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天建立高效液相色譜分析方法的一般步驟

通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問(wèn)題：①根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。②選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長(zhǎng)）和選用固定相（粒徑及孔徑）。③選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動(dòng)相的組成、流速及洗脫方式。④由獲得的色譜圖進(jìn)行定性分析和定量分析。

第17頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天下列優(yōu)良常規(guī)操作能夠最大限度降低維修費(fèi)用：使用HPLC級(jí)試劑和流動(dòng)相清潔的儀器、流動(dòng)相和樣品，如果必要，進(jìn)行過(guò)濾保證溶劑的相溶性如果必要，沖洗整個(gè)系統(tǒng)，去掉鹽，防止污染對(duì)儀器的使用、維護(hù)和保養(yǎng)進(jìn)行記錄第18頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜的應(yīng)用

第19頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、

醫(yī)藥方面

1、分離分析藥物的組合含量由于一種藥劑常含有多組分，色譜方法是既能分離又能定量的方法。如脂溶性維生素片，含有各維生素，用C18柱及含1%碳酸銨的甲醇為流動(dòng)相。一次即可將各維生素B6、D1、A、E同時(shí)分離并定出含量。又如止痛藥或退燒藥也可用此法分離并測(cè)得各組分的含量。第20頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、藥物生產(chǎn)中進(jìn)行中間控制生產(chǎn)抗菌素時(shí)，首先要了解發(fā)酵液中的主體與副產(chǎn)物的存在情況。例如：青霉素、四環(huán)素、頭孢子菌素、紅霉素、慶大霉素等的發(fā)酵產(chǎn)物，均可用C18柱和甲醇及緩沖液配制的流動(dòng)相或用離子對(duì)法，分析主體及其副產(chǎn)物的含量。對(duì)普魯卡因酰胺、茶堿等可進(jìn)行主體含量的測(cè)定，對(duì)硝酸甘油可測(cè)定主體含量及其降解產(chǎn)物，以便保證藥物的熱量。

第21頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、分析藥物在體內(nèi)的殘量：這是近來(lái)研究新藥效能很主要的內(nèi)容之一，如磺胺類藥品在血清及尿中含量也不允許太大，可用C18柱及酸性乙醇為流動(dòng)相，測(cè)定含量后，則可估計(jì)最合適的用藥劑量。4、測(cè)定藥物在各種器官中的代謝產(chǎn)物，特別是研究藥物的代謝產(chǎn)物在血清中存在的情況。如測(cè)血清中的酮酸及戊二酸。測(cè)尿中代謝產(chǎn)物更為方便，不需要繁鎖的預(yù)處理。因?yàn)檠芯磕蛑械慕M分能鑒別病人的代謝功能，對(duì)病理研究或臨床診斷均具有重要的參考價(jià)值。

第22頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、生化方面

主要方向是分析嘌呤、嘧啶基的核苷或核苷酸及具有相應(yīng)的肽和蛋白質(zhì)。

①在細(xì)胞核中有種類繁多的核苷酸，可用不同的檢測(cè)器或酶轉(zhuǎn)移檢測(cè)器或利用酶反應(yīng)進(jìn)行定性測(cè)定。用離子交換柱和緩沖游泳梯度淋洗。C18柱用含磷酸的緩沖水溶液的梯度淋洗法均能得到滿意的結(jié)果。第23頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天②分離RNA、DNA及碎片現(xiàn)在使用硅烷化的硅藻土或長(zhǎng)碳鏈季胺鹽涂漬等在上面制成系列填充柱，已能分離t-RNA,r-RNA及DNA碎片。還可利用此技術(shù)做RNA碎片的序列分離制備工具，對(duì)生物研究起了重要的作用。③氨基酸、肽、蛋白質(zhì)的分析氨基酸分析主要是制成熒光衍生物或酰氯的衍生物，然后測(cè)定其序列。近來(lái)也可用高效液相色譜的柱后衍生物法測(cè)定其序列。用四烷基氯化胺肽形成離子對(duì)或高效凝膠色譜測(cè)定蛋白質(zhì)，其分離效果也很好。④酶的分析酶是在血清及其他生理樣品中常有的反應(yīng)產(chǎn)物，化學(xué)分析法操作不便，易造成誤差，用色譜技術(shù)分析，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。第24頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤糖的分析。糖的分析是其它方法較難完成的。如把糖與硼酸緩沖液預(yù)選混合，使生成糖-硼酸絡(luò)合離子，再進(jìn)行分離。可把蔗乳糖、阿蘆糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、山梨糖、木糖、葡萄糖等幾十種，全部分開(kāi)。也可用胺基柱分離各種天然產(chǎn)物中伯糖的各繃分。第25頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、天然產(chǎn)物中主要組分的分析

天然物的組分非常復(fù)雜，如中草藥中各組分含量多少對(duì)藥劑作用影響很大。用此技術(shù)分離分析，具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。氨基柱能分離分析天然物中糖的組分。氰基柱能分離中藥紫草及其衍生物的組成。C18柱分離丹參中主要組分兒茶酚、桂皮中桂皮酸、煙草中的酚類化合物、麥角或鴉片中各種植物堿，這些都是近來(lái)日益受到重視的結(jié)果。第26頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、食品分析

分析食品或動(dòng)物飼料中的維生素含量，是當(dāng)前食品工業(yè)中的重要課題。分析食品中的黃曲霉素及各種香料，又是生產(chǎn)中的常用課題。如今此技術(shù)已在分析咖啡中的黃嘌泠、調(diào)料中的核苷酸及核苷、果汁中的有機(jī)酸、米中的維生素、牛奶中的維生素D等都對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供有效數(shù)據(jù)。分析食品中的有毒成分，如蘋(píng)果中農(nóng)藥萘乙酸、稻米中的黃曲霉素、魚(yú)體中的有機(jī)汞等。第27頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、環(huán)境分析

主要針對(duì)大氣中污染的成分分析，廢水和汽車尾氣中有害組分的分析。如柴油機(jī)排出的顆粒，用有機(jī)溶劑溶解后，經(jīng)色譜分析結(jié)果，有多環(huán)芳烴的硝基物，這是對(duì)人體健康有很大潛在危險(xiǎn)的化合物。又如藥廠排出的廢水中有大量硝酚；染料廠排出廢水中的苯胺等。用液相色譜分析簡(jiǎn)便迅速。第28頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、農(nóng)業(yè)分析

農(nóng)業(yè)中需要對(duì)各種作物中的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行各種含量分析。而液相色譜對(duì)多糖、脂肪酸蛋白質(zhì)等分析都是極為有效的方法，因此應(yīng)用頗為廣泛。第29頁(yè),共34頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、高分子材料的分析

高分子工業(yè)材料及生物高分子分析是近年來(lái)新興的課題。凝膠色譜是分離分析高分子組成及鑒定