膠原三肽標準

1T/XXXXXX—2024膠原三肽本文件適用于食品加工用途的膠原三肽產品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB31645食品安全國家標準膠原蛋白肽GB/T9695.23肉與肉制品羥脯氨酸含量測定GB2760食品安全國家標準食品添加劑使用標準GB5009.3食品安全國家標準食品中水分的測定GB5009.4食品安全國家標準食品中灰分的測定GB5009.5食品安全國家標準食品中蛋白質的測定GB5009.11食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定GB5009.12食品安全國家標準食品中鉛的測定GB5009.15食品安全國家標準食品中鎘的測定GB5009.17食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定GB5009.123食品安全國家標準食品中鉻的測定GB4789.1食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定GB4789.3食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1膠原三肽CollagenTripeptide以富含膠原蛋白的動物結締組織（包括皮、骨、筋、腱、鱗等）為原料,利用先進生物工程技術制備的膠原蛋白最小結構單元，是一種含有甘氨酸、脯氨酸（或羥脯氨酸）及一個其他氨基酸的三肽。4技術要求4.1原料要求可以使用的原料、禁止使用的原料，應符合GB31645的規(guī)定。4.2感官要求應符合表1的規(guī)定。2T/XXXXXX—2024表1感官要求自然光下觀察色澤和有無沉淀，聞其氣味，用溫4.3理化指標應符合表2的規(guī)定。表2理化指標膠原三肽所占比例/%特征三肽甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸（以干基計g/100g）≥羥脯氨酸（以干基計）/（g/100g）總氮（以干基計）/（g/100g）灰分/（g/100g）水分/（g/100g）GB5009.3第一法4.4污染物限量應符合表3的規(guī)定。表3污染物限量限量檢驗方法鉛（以Pb計）/（mg/kg）GB5009.l2鎘（以Cd計）/（mg/kg）GB5009.l5總砷（以As計）/（mg/kg）GB5009.ll鉻（以Cr計）/（mg/kg）2.0GB5009.l23總汞（以Hg計）/（mg/kg）GB5009.l74.5微生物限量應符合表4的規(guī)定。表4微生物限量ncmM52524.6食品工業(yè)用加工助劑食品工業(yè)用加工助劑的使用應符合GB2760的規(guī)定。3T/XXXXXX—2024（規(guī)范性）膠原三肽所占比例檢測方法（高效體積排阻色譜法）A.1方法提要采用高效體積排阻色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長214nm條件下檢測，根據標準品保留時間范圍來確定樣品色譜圖中膠原三肽的峰面積，利用膠原三肽峰面積與樣品色譜圖總峰面積的比值，計算樣品中膠原三肽所占比例。A．2儀器和設備A.2.1高效液相色譜儀：配有紫外可見光檢測器和含有數據處理軟件的色譜工作站。A.2.2流動相真空抽濾脫氣裝置。A.2.3超聲波振蕩器。A.2.4分析天平：感量0.0001g。A.2.5混勻器。A.2.6高壓蒸汽滅菌鍋。A.2.7吸量管：10mL、25mL。A.2.8容量瓶：10mL、100mL、500mL、1L。A.2.9燒杯：500mL、1L。A.2.10濾膜：孔徑0.22μm。A.2.11樣品瓶：1.5mL。A.2.12離心管：1.5mL。A.2.13試劑瓶：250mL、1L。A.2.14注射器：1mL。A.2.15量筒：100mL、250mL。A．3試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為色譜純。A.3.1三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）。A.3.2濃鹽酸（HCl）。A.3.3二水氯化鈣（CaCl2?2H2O）。A.3.4氯化鈉（NaCl）。A.3.6標準品：甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸(H-Glycine-Proline-Hydroxyproline-OH,分子量285.3，純度≥95%)。A．4溶液配制A.4.11M三(羥甲基)氨基甲烷溶液將60.57g三(羥甲基)氨基甲烷溶于盛有250mL水的500mL燒杯中，攪拌使其完全溶解。加入20mL濃鹽酸，攪拌均勻，pH穩(wěn)定后繼續(xù)慢慢的加入濃鹽酸至pH為7.5。轉移至500mL容量瓶中用水定容至刻度。然后轉移至1L的試劑瓶中用121℃高壓蒸汽滅菌20min。A.4.20.1M氯化鈣溶液將1.4701g二水氯化鈣溶于30mL水中，攪拌使其完全溶解。用水定容至100mL，然后轉移至250mL的試劑瓶中用121℃高壓蒸汽滅菌20min。4T/XXXXXX—2024A.4.3流動相的配制在1L燒杯中加入1M三(羥甲基)氨基甲烷溶液10mL，0.1M氯化鈣溶液50mL，氯化鈉8.7g，先加入500mL水進行攪拌使其完全溶解，轉移到容量瓶中用水定容至1L，混勻后用濾膜進行過濾。A．5色譜條件A.5.1色譜柱：SuperdexTM30Increase10/300GL并加裝保護柱。A.5.2檢測波長：214nm。A.5.3流速：0.3mL/min。A.5.4進樣體積：10μL。A.5.5分析時間：75min。A．6標準品色譜圖用流動相配制成濃度為1%的標準品溶液，用濾膜過濾后進樣，得到標準品的色譜圖。A.7樣品的制備用稱量紙稱取樣品0.1g，轉移至10mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，用混勻器進行完全溶解。用濾膜過濾，其濾液用于測定。A.8膠原三肽所占比例的計算將A.7制備的樣品溶液在A.5色譜條件下進樣分析。然后根據公式（1）進行計算X=×100%……………（1）式中：X:試樣中膠原三肽的相對百分比，單位%；A:試樣中膠原三肽的峰面積；B:試樣中總峰面積。結果保留兩位有效數字。5T/XXXXXX—2024（規(guī)范性）特征三肽甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸含量檢驗方法B.1原理采用反相色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，根據樣品組分分子體積大小的差別進行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220nm條件下檢測，使用數據處理軟件根據標準品的面積和濃度制作標準直線方程。并計算得到甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸在樣品中所占比例。B.2試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為色譜純。B.2.1三氟乙酸（C2HF3O2）。B.2.3標準品：甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸（H-Glycine-Proline-Hydroxyproline-OH,MW285.3）。B.3.色譜條件B.3.1色譜柱：ZORBAXSB-Aq,4.6×250mm5μm。B.3.2流動相：0.1%三氟乙酸溶液。B.3.3檢測波長：220nm。B.3.4流速：1mL/min。B.3.5柱溫箱：50℃。B.3.6進樣體積：10μL。B.3.7分析時間：15min。B.4標準曲線的建立用流動相配制成濃度為1%的標準品溶液，用流動相進行稀釋，分別制成濃度為0.001%(10μg/mL),0.002%(20μg/mL),0.003%(30μg/mL),0.004%(40μg/mL),0.005%(50μg/mL)，用濾膜過濾后進樣，使用數據處理軟件根據標準品的面積和濃度制作標準直線方程。B.5樣品的制備用稱量紙稱取樣品0.1g，轉移至10mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，再用流動相進行10倍稀釋，得到濃度為0.1%的樣品溶液。用濾膜過濾，其濾液用于測定。B.6甘氨酸