斑蘭葉及其制品中角鯊烯的測定

1斑蘭葉及其制品中角鯊烯的測定本標準規(guī)定了斑蘭葉及其制品中角鯊烯含量的三種測定方法：氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法。本標準適用于斑蘭葉、斑蘭粉、斑蘭漿及斑蘭制品中角鯊烯的測定。當稱取樣品0.2g時，氣相色譜法的定量限為50mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜法的定量限為2.5mg/kg，高效液相色譜法的定量限為30mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T3673植物油中角鯊烯SN/T4785出口植物油中角鯊烯的測定LS/T6120糧油檢驗植物油中角鯊烯的測定氣相色譜法T/GDWJ001食用斑蘭葉（粉）T/HIFSA0004斑蘭粉T/HIFSA0005斑蘭漿3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1斑蘭葉pandanleaf斑蘭葉,學名香露兜葉，采自人工種植的露兜樹科露兜樹屬植物香露兜（PandanusamaryllifoliusRoxb）的葉片，經(jīng)挑選、清洗或挑選、清洗、干燥而成。3.2斑蘭烘干粉pandanleafdryingpowder以人工種植的斑蘭葉為主要原料，經(jīng)預處理、打漿、提取、離心或不離心、過濾或不過濾、烘干、粉碎、包裝等工藝制成的粉末。3.3斑蘭凍干粉pandanleaffreeze-driedpowder以人工種植的斑蘭葉為主要原料，經(jīng)預處理、打漿、提取、離心或不離心、過濾或不過濾、低溫真空干燥、粉碎、包裝等工藝制成的粉末。3.4斑蘭速溶粉pandanleafinstantpowder以人工種植的斑蘭葉為主要原料，經(jīng)預處理、打漿、提取、離心或不離心、過濾或不過濾、真空干燥、粉碎、噴霧干燥、包裝等工藝制成的粉末。23.5斑蘭漿pandansyrup以人工種植的香露兜（PandanusamaryllifoliusRoxb）葉（斑蘭葉）鮮葉為主要原料，經(jīng)預處理、榨汁、過濾或不過濾，添加或不添加適量的添加劑，經(jīng)殺菌或不殺菌、灌裝、速凍等生產(chǎn)工藝制成的勻漿。3.6斑蘭制品以斑蘭為輔料，經(jīng)相應工藝加工制成的產(chǎn)品。第一法氣相色譜法4原理樣品經(jīng)過氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，其中的角鯊烯用正己烷提取，采用氣相色譜法測定，外標法定量。5試劑與材料除另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1試劑5.1.1氫氧化鉀。5.1.2無水乙醇。5.1.3正己烷：色譜純。5.2試劑配制氫氧化鉀-乙醇溶液（約2mol/L）:準確稱?。?12±0.1）g氫氧化鉀，加入200mL的無水乙醇（5.1.2進行溶解，然后用無水乙醇（5.1.2）稀釋定容至1000mL。5.3標準品角鯊烯標準品：純度≥98.0%。5.4標準溶液配制5.4.1角鯊烯標準儲備液（1.00mg/mL）:準確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的角鯊烯標準品（5.3）100mg(精確至0.1mg)，加正己烷溶解并置于100mL棕色容量瓶（6.7）中，定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.00mg/mL的標準儲備液。標準儲備液可于4℃條件下避光保存3個月。5.4.2角鯊烯標準中間液（100μg/mL）:準確吸取1.00mL角鯊烯標準儲備液（5.4.1）于10mL棕色容量瓶（6.7）中，用正己烷定容至刻度，混勻備用。5.4.3角鯊烯標準系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標準中間液（5.4.2），用正己烷稀釋，使標準工作溶液濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL。6儀器和設備6.1氣相色譜儀：配氫火焰離子檢測器（FID）。6.2分析天平：精度0.0001g。6.3渦旋振蕩器。36.4恒溫水浴鍋。6.5離心機。6.6氮吹儀。6.7棕色容量瓶：10mL。6.8微孔濾膜：0.22μm，有機系。6.9離心管：15mL。6.10玻璃試管:10mL。6.11組織搗碎機。6.12超聲儀。7試樣制備7.1斑蘭葉和斑蘭制品取一定數(shù)量的具有代表性的樣品，用組織搗碎機（6.11）粉碎，樣品充分混合均勻后，備用。7.2斑蘭粉和斑蘭漿取一定數(shù)量的具有代表性的樣品，充分混合均勻后，備用。8分析步驟8.1稱樣準確稱取0.2g（精確至0.0001g）試樣，置15mL離心管（6.9）中。8.2角鯊烯的提取于裝有試樣的離心管中加入2mL氫氧化鉀-乙醇溶液（5.2），置超聲儀（6.12）超聲皂化30min（在75℃條件下）后，取出離心管，冷卻至室溫；加入2mL水、1mL正己烷（5.1.3）提取，離心管至渦旋振蕩器（6.3）混勻5min，充分提??；5000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至10mL玻璃試管（6.10）中。再用1mL正己烷（5.1.3）重復提取操作3次，并將4次提取的上清液合并至10mL玻璃試管（6.10）中，置于渦旋振蕩器中混勻，用氮吹儀（6.6）吹干，立即加入1mL正己烷（5.1.3）復溶，振搖1min，過0.22μm濾膜上機。8.3氣相色譜參考條件8.3.1色譜柱：HP-5毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱，或等效色譜柱。8.3.2進樣口溫度：280℃。8.3.3升溫程序：160℃保持1min，以15℃/min速率升至220℃保持2min，以5℃/min速率升至280℃保持22min。8.3.4載氣：高純氮氣（純度99.999%），流速1.0mL/min，分流比4:1。8.3.5FID檢測器溫度：280℃,氫氣流速40mL/min，空氣流速300mL/min，尾吹氣（N2）30mL/min。8.3.6進樣量：1μL。8.3.7標準曲線的制作將角鯊烯標準系列工作溶液（5.4.3）依次按上述推薦色譜條件上機測定，記錄色譜圖峰面積，以標準工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。48.4試樣溶液的測定在上述色譜條件下測得樣品溶液中角鯊烯的保留時間，與標準溶液的保留時間比較定性，以色譜峰峰面積定量。8.4.1空白試驗除不加試樣外，均按上述步驟進行操作。9結(jié)果計算樣品中角鯊烯含量按式（1）計算： 式中：X—試樣中角鯊烯的含量，單位為毫克每千克（mg/kgc—試樣提取液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLc0—空白溶液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLv—試樣提取液體積，單位為毫升（mLm—樣品稱樣量，單位為克（gf—稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。10精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。第二法氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）11原理樣品經(jīng)過氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，其中的角鯊烯用正己烷提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜儀測定，外標法定量。12試劑與材料除另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。12.1.1試劑12.1.2試劑配制12.1.3標準品角鯊烯標準品：純度≥98.0%。12.1.4標準溶液配制12.1.5角鯊烯標準儲備液（1.00mg/mL）:準確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的角鯊烯標準品（12.3）100mg(精確至0.1mg)，加正己烷溶解并置于100mL棕色容量瓶（13.7）中，定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.00mg/mL的標準儲備液。標準儲備液可于4℃條件下避光保存3個月。12.1.6角鯊烯標準中間液（100μg/mL）:準確吸取1.00mL角鯊烯標準儲備液（12.4.1）于10mL棕色5容量瓶（13.7）中，用正己烷定容至刻度，混勻備用。12.1.7角鯊烯標準系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標準中間液（12.4.2），用正己烷稀釋，使標準工作溶液濃度分別為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。13儀器和設備13.1氣相色譜-質(zhì)譜儀：配有電子轟擊電離源（EI）。13.2分析天平：精度0.0001g。13.3渦旋振蕩器。13.4恒溫水浴鍋。13.5離心機。13.6氮吹儀。13.7棕色容量瓶：10mL。13.8微孔濾膜：0.22μm，有機系。13.9離心管：15mL。13.10玻璃試管:10mL。13.11組織搗碎機。13.12超聲儀。14試樣制備同第一法7。15分析步驟15.1稱樣15.2角鯊烯的提取同第一法8.2。15.3氣相色譜參考條件15.3.1色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱，或等效色譜柱。15.3.2進樣口溫度：280℃。15.3.3升溫程序：180℃保持1min，以3℃/min升至280℃保持15min。15.3.4載氣：高純氮氣（純度99.999%），流速：1.0mL/min。15.3.5進樣方式：分流，分流比50:1。15.3.6進樣量：1.0μL。15.4質(zhì)譜參考條件15.4.1質(zhì)譜儀：質(zhì)譜檢測器（配置電子轟擊離子源）。15.4.2離子源：電子轟擊離子源（EI）。615.4.3GC-MS接口溫度：280℃。15.4.4離子源溫度：230℃。15.4.5進樣口溫度：280℃。15.4.6EI離子源：70eV。15.4.7檢測方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）模式：定性離子為m/z69、81、95、137，定量離子為m/z69。15.5標準曲線的制作將角鯊烯標準系列工作溶液（12.4.3）分別注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，測定相應的角鯊烯的色譜峰面積，以標準工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。15.6試樣溶液的測定將試樣溶液分別注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，得到相應的角鯊烯的峰面積，根據(jù)標準曲線得到待測液中角鯊烯的濃度。15.7定性測定將角鯊烯標準系列工作溶液（12.4.3）和樣品溶液依次按上述推薦氣相色譜-質(zhì)譜條件上機測定，在相同試驗條件下，待測物在樣品中的保留時間與標準工作液中的保留時間，并且色譜圖中各組分定性例子對的相對豐度與濃度接近標準工作液中相應定性離子的相對豐度進行比較，在偏差范圍內(nèi)，則可判斷為樣品中存在對應的待測物。角鯊烯的GC/MS色譜圖和選擇離子質(zhì)譜圖見附錄A.1和A.2。15.8空白試驗除不加試樣外，均按上述步驟進行操作。15.9結(jié)果計算樣品中角鯊烯含量按式（2）計算：式中：X—試樣中角鯊烯的含量，單位為毫克每千克（mg/kgc—試樣提取液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLc0—空白溶液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLv—試樣提取液體積，單位為毫升（mLm—樣品稱樣量，單位為克（gf—稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。15.10精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。第三法高效液相色譜法（HPLC）16原理樣品經(jīng)過氫氧化鉀-乙醇溶液皂化后，其中的角鯊烯用正己烷提取，采用高效液相色譜測定，外標法定量。17試劑與材料7除另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。17.1試劑17.1.1氫氧化鉀。17.1.2無水乙醇。17.1.3乙腈：色譜純。17.1.4叔丁基甲醚：色譜純。17.1.5正己烷：色譜純。17.2試劑配制進行溶解，然后用無水乙醇（17.1.2）稀釋定容至1000mL。17.3標準品角鯊烯標準品：純度≥98.0%。17.4標準溶液配制角鯊烯標準儲備液（1.00mg/mL）:準確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的角鯊烯標準品（17.3）100mg(精確至0.1mg)，加正己烷溶解并置于100mL棕色容量瓶（18.7）中，定容至刻度，搖勻，得到濃度為1.00mg/mL的標準儲備液。標準儲備液可于4℃條件下避光保存3個月。17.4.1角鯊烯標準中間液（100μg/mL）:準確吸取1.00mL角鯊烯標準儲備液（17.4.1）于10mL棕色容量瓶（18.7）中，用正己烷定容至刻度，混勻備用。17.4.2角鯊烯標準系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標準溶液（17.4.1）或角鯊烯標準中間液（17.4.2用正己烷稀釋，使標準工作溶液濃度分別為10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μ400μg/mL。17.4.3角鯊烯標準系列工作溶液：分別吸取適量角鯊烯標準溶液（17.4.1）或角鯊烯標準中間液（17.4.2用正己烷稀釋，使標準工作溶液濃度分別為10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μ400μg/mL。18儀器和設備18.1高效液相色譜儀：配紫外檢測器。18.2分析天平：精度0.0001g。18.3渦旋振蕩器。18.4恒溫水浴鍋。18.5離心機。18.6氮吹儀。18.7棕色容量瓶：10mL。18.8微孔濾膜：0.22μm，有機系。18.9離心管：15mL。18.10玻璃試管:10mL。18.11組織搗碎機。18.12超聲儀。19試樣制備8同第一法7。20分析步驟20.1稱樣20.2角鯊烯的提取同第一法8.2。20.3液相色譜測定條件20.3.1色譜柱：C18柱（250mm×4.6μm，5μm），或相當者；20.3.2流動相：乙腈/叔丁基甲醚（75+25，體積比）；20.3.3流速：1.0mL/min；20.3.4柱溫：35℃;20.3.5檢測波長：210nm；20.3.6進樣量：10μL。20.4標準曲線的制作將角鯊烯標準系列工作溶液（17.4.3）依次按上述推薦色譜條件上機測定，記錄色譜圖峰面積，以標準工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。20.5試樣溶液的測定在上述色譜條件下測得樣品溶液中角鯊烯的保留時間，與標準溶液的保留時間比較定性，以色譜峰峰面積定量。21結(jié)果計算樣品中角鯊烯含量按式（3）計算：式中：X—試樣中角鯊烯的含量，單位為毫克每千克（mg/kgc—試樣提取液中角鯊烯的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLv—試樣提取液體積，單位為毫升（mLm—樣品稱樣量，單位為克（gf—稀釋倍數(shù)。計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。22精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。RelativeAbundanceRelativeAbundance附錄B（規(guī)范性）附錄C色譜圖和質(zhì)譜圖A.1角鯊烯標準品的GC/MS色譜圖見圖A.1。 2.45E8 2.45E8656045402520