淮陰苜蓿耐熱的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

淮陰苜蓿耐熱的蛋白質(zhì)組學(xué)研究高溫是植物生長的主要限制因子之一。世界氣象組織(IPCC)報告在21世紀(jì)末溫度可能增長1.4到5.8℃。在溫帶地區(qū),極端的高溫氣候?qū)⒊霈F(xiàn)的更加頻繁。溫度的升高對世界范圍內(nèi)的作物產(chǎn)量會造成嚴(yán)重的危害?；搓庈俎?MedicagosativaL.cv.HuaiYin)是我國唯一一個生長在江淮地區(qū)的苜蓿類型,具有極耐高溫、高濕特性,是我國寶貴的苜蓿品種之一。研究高溫脅迫下淮陰苜蓿蛋白質(zhì)組的變化,將對植物在高溫脅迫下的應(yīng)答機(jī)制有一個更加深入的了解,并為植物耐熱相關(guān)新品種的選育提供方向。研究首先利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR標(biāo)記鑒定了淮陰苜蓿的種質(zhì)特性及種內(nèi)遺傳變異。在成功建立一個雙向電泳體系的基礎(chǔ)上,研究了淮陰苜蓿對不同高溫脅迫的生理和蛋白響應(yīng)。并進(jìn)一步對40℃不同處理時間淮陰苜蓿蛋白質(zhì)組進(jìn)行雙向電泳分離,運(yùn)用PDQuest8.0.1軟件分析差異蛋白點(diǎn),并通過質(zhì)譜技術(shù)和Mascot工具對分析獲得差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定,在蛋白質(zhì)組學(xué)的角度探討了高溫下淮陰苜蓿的響應(yīng)和可能機(jī)制。1、淮陰苜蓿種質(zhì)特性及種內(nèi)變異的分析研究通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR標(biāo)記,分析了淮陰苜蓿的種質(zhì)特性及種內(nèi)變異。結(jié)果表明,淮陰苜蓿具有開花早,生育期短的特性,整個生育期約為249天。秋眠級1.7158,是個極秋眠品種?；搓庈俎３趸ㄆ谥旮?1.8-136.2cm；分枝數(shù)9-80個；主莖節(jié)間數(shù)13-23個；葉長2.5-4.4cm；葉寬0.8-2.49cm；主莖傾斜角度8.26-58.4°,趨于直立,淮陰苜蓿各形態(tài)特性的平均變異系數(shù)為24.2%。對淮陰苜蓿SSR的分析表明,淮陰苜?；蚨鄻有灾笖?shù)為25.32%。聚類分析結(jié)果表明,淮陰苜蓿單株間平均遺傳距離為10.26,相似系數(shù)平均為0.8。與其它苜蓿品種相比,淮陰苜蓿遺傳多樣性水平較低,大多數(shù)單株表現(xiàn)出相似的形態(tài)特征?；搓庈俎］^高的一致性可能與生長的地理環(huán)境有關(guān)?；搓庈俎７N內(nèi)變異的分析也為苜蓿蛋白質(zhì)組研究的取樣提供依據(jù)。2、適用于苜蓿葉片的雙向電泳技術(shù)以蒺藜苜蓿葉片為研究材料,對TCA-丙酮蛋白提取法、聚焦和凝膠染色方法等進(jìn)行一系列優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn),采用改進(jìn)的TCA-丙酮法提取總蛋白,17cmpH3-10的固定化梯度膠條聚焦123,000伏時,12%的SDS進(jìn)行垂直電泳,膠體考染法染色可以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究認(rèn)為,改進(jìn)的TCA-丙酮法能更好的去除樣品中的雜質(zhì),獲得更好的聚焦效果。同時也發(fā)現(xiàn),2-DE的聚焦效果與聚焦伏時和蛋白上樣量相關(guān),更大的蛋白上樣量需要更長的聚焦時間才能使蛋白更好的聚焦,獲得清晰的2-DE圖譜。聚焦伏時過大,超過115,000伏時的情況下,會引發(fā)由于過度聚焦引起的水分和蛋白遷移,導(dǎo)致大量水平條紋對2-DE圖譜產(chǎn)生干擾。在此基礎(chǔ)上建立了一個適用于淮陰苜蓿葉片的雙向電泳體系。3、淮陰苜蓿對不同高溫脅迫的響應(yīng)為了研究淮陰苜蓿對不同高溫脅迫的響應(yīng),研究分析了不同溫度下(25℃、30℃、35℃和40℃)淮陰苜蓿的TTC降解能力、膜的熱穩(wěn)定性、丙二醛含量和蛋白質(zhì)組這四個方面的變化。研究發(fā)現(xiàn),溫度大于30℃就會引起由于膜穩(wěn)定性降低和膜脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷,細(xì)胞損傷隨著時間的延長會逐漸恢復(fù)。與對照相比,在30v的環(huán)境條件下,淮陰苜蓿細(xì)胞活力呈先升高后降低,再升高的趨勢,在35和40℃的條件下,淮陰苜蓿細(xì)胞活力呈下降趨勢,這個趨勢在脅迫12h后得到緩解。35和40℃均會誘導(dǎo)脅迫蛋白的產(chǎn)生,但40℃誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的脅迫蛋白。與35℃熱激處理的植株相比,40℃熱激處理的淮陰苜蓿植株顯示出更強(qiáng)的恢復(fù)能力。這些生理和蛋白質(zhì)組的變化說明淮陰苜蓿具有耐受高溫的能力,同時也為苜蓿耐熱蛋白質(zhì)組的研究提供理論基礎(chǔ)。4、淮陰苜蓿耐熱的蛋白質(zhì)組學(xué)研究淮陰苜蓿在蛋白質(zhì)組方面對高溫脅迫的響應(yīng)尚不清楚。在這個研究中,淮陰苜蓿幼苗生長在不同溫度25℃(對照)和40℃(高溫處理)的生長室中,分別在處理后的24、48和72h收集植株葉片作為研究材料。研究分析了高溫對淮陰首蓿表型、生理和蛋白質(zhì)組學(xué)的影響。在蛋白質(zhì)組的分析上采用雙向電泳技術(shù)對提取蛋白進(jìn)行分離,4個階段共有1.5倍以上差異的蛋白點(diǎn)96個,對這些蛋白點(diǎn)進(jìn)行切膠酶解,質(zhì)譜成功鑒定了96個差異表達(dá)蛋白點(diǎn)中的81個。其中的5個蛋白進(jìn)一步進(jìn)行了mRNA水平的分析。蛋白質(zhì)組的分析結(jié)果對苜蓿耐熱的機(jī)理將在分子水平上有一個更好的認(rèn)識。通過生物信息學(xué)分析,根據(jù)蛋白的功能將這些蛋白進(jìn)行分類：證實(shí)這些蛋白與代謝相關(guān)的占7%,與能量相關(guān)的占48%,與蛋白合成相關(guān)的占1%,與蛋白運(yùn)輸/儲存相關(guān)的占6%,與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的占4%,與胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)的占2%,與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的占1%,與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)7%和疾病防御相關(guān)的占24%。這些蛋白位于細(xì)胞的中的葉綠體基質(zhì)(21%)、葉綠體類囊體(5%)、細(xì)胞質(zhì)(41%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(9%)、微體(2%)、線粒體基質(zhì)(11%)、細(xì)胞核(4%)、細(xì)胞周質(zhì)(4%)、細(xì)胞質(zhì)膜(1%)和液泡(2%)。在此基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道,對這些差異蛋白質(zhì)的功能、與耐熱的關(guān)系以及所起的作用等方面進(jìn)行了分析討論。高溫逆境下,植株需要大量的能量用于啟動機(jī)體的防御性機(jī)制,比如抗氧化酶和熱激蛋白。熱激誘導(dǎo)與氨基酸代謝、蛋白合成、加工和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)量的上調(diào),為脅迫響應(yīng)蛋白的合成做準(zhǔn)備。同時也促進(jìn)了各種氨基酸的積累,增強(qiáng)了細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力。熱激促進(jìn)了淮陰苜蓿的光合作用