巴西橡膠樹(shù)冷脅迫誘導(dǎo)DNA甲基化修飾研究

巴西橡膠樹(shù)冷脅迫誘導(dǎo)DNA甲基化修飾研究巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)起源于亞馬孫河流域低緯度地區(qū)的熱帶雨林。上世紀(jì)80年代,橡膠種植向高緯度非傳統(tǒng)種植區(qū)擴(kuò)展,寒害成為限制橡膠種植和產(chǎn)量的主要因素之一,橡膠種植能夠向高緯度區(qū)域擴(kuò)展也被認(rèn)為是受益于選育出耐寒的橡膠品種。然而,巴西橡膠樹(shù)的種質(zhì)資源多樣性不足,橡膠樹(shù)的生育周期又很長(zhǎng),加上橡膠種子大并且種植密度較低,使橡膠樹(shù)雜交育種變得十分困難。但為什么橡膠耐寒品種能夠在這么短的時(shí)間內(nèi)培育出來(lái),其中到底蘊(yùn)含怎樣的分子機(jī)制?值得進(jìn)行探索。為此,本文從表觀遺傳學(xué)的角度研究橡膠冷脅迫相關(guān)的分子機(jī)理,取得以下研究結(jié)果:(1)首先,為了研究低溫通路中應(yīng)答基因和甲基化相關(guān)基因是否受低溫的誘導(dǎo)。對(duì)海南主栽品種熱研7-33-97無(wú)性系克隆組培苗進(jìn)行短期冷處理,qRT-PCR結(jié)果顯示,冷脅迫關(guān)鍵基因HBICE1和HbCBF2,冷脅迫應(yīng)答基因(COR)和DNA甲基化相關(guān)基因(如HbMET)的表達(dá)都受到冷脅迫誘導(dǎo),表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度改變。(2)其次,為了鑒定冷脅迫處理是否引起表觀遺傳學(xué)修飾的改變,對(duì)熱研7-33-97無(wú)性系組培苗進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間冷脅迫處理,發(fā)現(xiàn)處理會(huì)造成組培苗明顯的表型變化,如葉片變黃、葉綠素含量降低和生長(zhǎng)受到抑制。全基因組的甲基化CpG島擴(kuò)增法掃描差異分析(MCA)顯示,長(zhǎng)時(shí)間的冷脅迫處理使橡膠全基因組CpG島的甲基化修飾發(fā)生改變。此外,長(zhǎng)時(shí)間冷脅迫處理不僅提高了冷脅迫關(guān)鍵基因(HbICE1、HbCBF2和COR基因等)和DNA甲基化相關(guān)基因HbMET的轉(zhuǎn)錄活性水平,而且還誘導(dǎo)了HbICE1、HbCBF2和HbMET基因啟動(dòng)子DNA去甲基化。但長(zhǎng)時(shí)間冷脅迫只提高DNA去甲基化相關(guān)基因如HbDMEs,HbROS和和HbDMLs的轉(zhuǎn)錄水平,沒(méi)有改變這些基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。而且,針對(duì)DNA去甲基化相關(guān)基因家族的短時(shí)間、多品種和組織特異性的表達(dá)分析。進(jìn)一步證明了DNA去甲基化家族基因由于低溫的長(zhǎng)時(shí)間的積累脅迫,影響了其相關(guān)基因表達(dá)機(jī)制更加明顯的變化。(3)為了進(jìn)一步研究在自然條件下冷脅迫關(guān)鍵基因和DNA甲基化相關(guān)基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),分別在4月份和10月份兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)從海南三亞市、海南文昌市、云南西雙版納和云南普洱市4個(gè)不同緯度的橡膠園取樣,然后進(jìn)行基因表達(dá)分析和DNA甲基化分析。研究結(jié)果顯示,HbICE1和HbMET基因啟動(dòng)子在4月份收集的海南文昌市,云南西雙版納和云南普洱市3個(gè)不同緯度橡膠園的樣品中出現(xiàn)了普遍的去甲基化現(xiàn)象,而在三亞市收集的樣品未出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象。在10月份收集的幾乎所有樣品中,HbICE1和HbMET基因啟動(dòng)子出現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象。這種DNA甲基化修飾與溫度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性,但與橡膠品種沒(méi)有相關(guān)性,表明環(huán)境溫度可能通過(guò)DNA甲基化修飾改變冷脅迫相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)修飾,從而影響這些基因的表達(dá)和橡膠的耐寒性。(4)為了研究在自然條件下冷脅迫相關(guān)基因和DNA甲基化相關(guān)基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)與差異表達(dá)之間可能存在的相關(guān)性,利用基因表達(dá)分析和熱圖展示,揭示了冷脅迫誘導(dǎo)的DNA去甲基化與COR基因的表達(dá)水平存在高度相關(guān)性;在12個(gè)橡膠品種的HbICE1和HbMET基因啟動(dòng)子序列中的SNP數(shù)目很少,說(shuō)明橡膠耐寒相關(guān)基因的遺傳變異很少,橡膠的耐寒性與表觀遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性更高。橡膠受到的冷誘導(dǎo)的表觀遺傳修飾比通過(guò)長(zhǎng)期耐寒性或其他生物非生物脅迫造成遺傳變異更為重要。(5)為了全面篩選低溫處理差異表達(dá)的基因,將長(zhǎng)時(shí)間低溫處理的樣品進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜分析(DGE),發(fā)現(xiàn)低溫處理誘導(dǎo)3693個(gè)基因表達(dá)量上調(diào),2043個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。差異表達(dá)基因在KEGG代謝通路分類(lèi)中主要在代謝(Metabolism),環(huán)境信息處理(EnvironmentalInformationProcessing),遺傳信息處理(GeneticInformationProcessing),有機(jī)體系統(tǒng)(OrganismalSystems),和細(xì)胞過(guò)程(CellularProcesses)等五個(gè)代謝通路中富集,在122個(gè)通路都有不同程度的表達(dá)水平的變化。(6)最后,為揭示冷脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)基因與DNA甲基化修飾之間是否存在相關(guān)性,進(jìn)行了橡膠樹(shù)冷脅迫處理的全基因組簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序(ReducedRepresentationBisulfiteSequencing,RRBS)分析。研究結(jié)果表明,長(zhǎng)時(shí)間低溫處理后橡膠基因組的CpG島發(fā)生普遍去甲基化現(xiàn)象,廣泛地分布在基因的編碼區(qū)及功能調(diào)控區(qū)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了個(gè)性化的RNA-seq數(shù)據(jù)貫穿RRBS數(shù)據(jù)的分析。通過(guò)分析冷脅迫差異表達(dá)基因的甲基化區(qū)域(DMR)的分布,發(fā)現(xiàn)在基因上游2kb序列中,距離編碼區(qū)越遠(yuǎn),DNA甲基化程度越高,而低溫處理后DNA去甲基化程度明顯提高,發(fā)生去甲基化的CpG島類(lèi)型主要是CHG和CHH。非常有趣的是,低溫處理后基因組中轉(zhuǎn)座子序列的甲基化程度有所提高,甲基化水平提高的CpG島類(lèi)型主要是CG型。對(duì)貫穿得到全基因組差異基因的甲基化差異分布及數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)400多個(gè)甲基化差異變化明顯的基因,鋅指蛋白基因、葉綠體相關(guān)基因以及脅迫相關(guān)基因,這些基因的甲基化水平和表達(dá)水平都受到低溫處理的影響。綜上所述,巴西橡膠樹(shù)低溫信號(hào)途徑的相關(guān)基因、DNA甲基化以及去甲基化相關(guān)基因的表達(dá)均受低溫調(diào)控,長(zhǎng)時(shí)間的冷脅迫會(huì)誘導(dǎo)HbICE1、HbCBF2和HbMET基因的啟動(dòng)子DNA發(fā)生去甲基化。在自然條件下,不同橡膠品種的HbICE1和HbMET基因啟動(dòng)子的甲基化修飾出現(xiàn)周期變化,即冬季的溫度較低地區(qū)不同橡膠品種的HbICE1和HbMET基因啟動(dòng)子出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象,而溫度較高的地區(qū)和溫度較高的季節(jié)則維持基因啟動(dòng)子甲基化水平。由于不同品種的HbICE和HbMET基因啟動(dòng)子序列幾乎不存在差異,因此可以認(rèn)為,橡