課題微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

關(guān)于課題微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)放線菌第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天真菌青霉菌第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天黑曲霉酵母菌第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

微生物是一般肉眼看不見或看不清的微小生物，個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，通常要用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物，統(tǒng)稱為微生物。微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌、和少數(shù)藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。）第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天想一想這些肉眼看不到的微生物是怎樣獲得呢？第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天你知道固體培養(yǎng)基的來歷嗎？為了能直接觀察培養(yǎng)物的形態(tài)及生長情況，科學(xué)家希望能將微生物培養(yǎng)在固體表面上，就像微生物生長在橘子皮或土豆上一樣。最初，德國醫(yī)生羅伯特·科赫此試著用明膠作培養(yǎng)基的凝固劑。但是，人們很快發(fā)現(xiàn)，明膠在20℃以上就變軟了，很難進(jìn)行分離微生物的劃線操作。而大多數(shù)細(xì)菌的培養(yǎng)溫度都不低于25℃。科赫的同事WalterHesse發(fā)現(xiàn)瓊脂比明膠更適合做培養(yǎng)基的凝固劑。這個改進(jìn)的方法很快就被大家采納。第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型配制特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多微生物的分離、計(jì)數(shù)等半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少觀察微生物運(yùn)動、鑒定菌種、保藏菌種等液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學(xué)物質(zhì)培養(yǎng)、分離出特定的微生物第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天思考：1、固體和液體培養(yǎng)基的區(qū)別？固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基你認(rèn)為哪個更適合工業(yè)生產(chǎn)？為什么？液體培養(yǎng)基；微生物與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)接觸充分，快速生長繁殖和產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入四環(huán)素、卡那霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞可抑制細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁主要成分肽聚糖的合成其細(xì)胞壁是由纖維素、幾丁質(zhì)、葡聚糖組成第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天牛肉膏（BeefExtract）又稱牛肉浸膏，是采用新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色。現(xiàn)在，市場上出現(xiàn)了一些熟食店、面館為牟利而用牛肉膏將豬肉“變”牛肉的現(xiàn)象第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天蛋白胨從來源上可分為動物性蛋白胨和植物性蛋白胨。胰胨、肉胨、骨胨等都是動物性蛋白胨，而大豆蛋白胨等則是植物性蛋白胨。動物性來源的蛋白胨還有：蠶蛹蛋白胨、血液蛋白胨等。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，如將牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明膠、大豆蛋白、絲蛋血纖維蛋白等為原料，經(jīng)不完全的水解工藝所得的產(chǎn)物。市售產(chǎn)品以淡黃至棕黃色粉劑為主。其分子量介于月示和肽之間，約2000左右。不同來源的蛋白質(zhì)和不同的水解條件，其水解物中組成可千差萬別。所以胨往往是一個復(fù)雜的多肽混合物?？扇苡谒?，過熱不凝固，在飽和硫酸銨中不發(fā)生沉淀但可為蛋白質(zhì)沉淀劑所沉淀?？捎米魑⑸锖蛣游锛?xì)胞培養(yǎng)基、特種功能性食品和化妝品的配料，也有用作啤酒等產(chǎn)品的穩(wěn)定劑。鮮骨蛋白胨采用新鮮骨為原料，經(jīng)發(fā)酵噴霧干燥而成。廣泛用于黃原膠、食品添加劑、醫(yī)藥中間體、生物制品等發(fā)酵產(chǎn)品中第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天菌落:單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天觀察菌落特征。如：粗糙與光滑程度2、記得不用顯微鏡如何區(qū)分S型細(xì)菌和R型細(xì)菌嗎？第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二、無菌技術(shù)1、什么是無菌技術(shù)無菌技術(shù)泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天[思維激活]

用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)者手臂屬消毒還是滅菌？70%與95%的酒精，哪一種效果更好？為什么？

提示酒精擦拭屬化學(xué)消毒，酒精消毒時，70%的酒精殺菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。消毒和滅菌的區(qū)別條件結(jié)果常用的方法消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學(xué)藥物消毒法滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌孢子細(xì)菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成新個體。第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天比較項(xiàng)理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒滅菌較為溫和強(qiáng)烈部分生活狀態(tài)的微生物不能全部微生物能第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天三、實(shí)驗(yàn)安排本實(shí)驗(yàn)采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程分為兩個階段：1、制備培養(yǎng)基2、純化大腸桿菌大腸桿菌第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1、制備培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容至1000mL（1）計(jì)算根據(jù)下列培養(yǎng)基配方比例，計(jì)算配置100mL培養(yǎng)基時，各成分的用量。第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（2）稱量注意

牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。蛋白胨牛肉膏用玻璃棒挑取牛肉膏第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（3）溶化①加水加熱熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化鈉繼續(xù)加熱；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（5）滅菌在壓力為100kPa，溫度為121℃條件下，滅菌15-30min。（6）倒平板（4）調(diào)節(jié)PH第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天倒平板技術(shù)第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。討論1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,又可以避免培養(yǎng)基中的水分過快地?fù)]發(fā)。第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法①平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.在數(shù)次劃線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天平板劃線操作1.將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅2.在火焰旁冷卻接種環(huán)、并打開棉塞第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3.將試管口通過火焰。5.將試管口通過火焰，并塞上棉花。4.將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取一環(huán)菌液。不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。6.左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天8.將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作。在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)域的劃線與第一區(qū)域相連。第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)劃線分離法注意事項(xiàng):其他畫線分離圖：第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天不同的平板劃線法第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基表面的單菌落第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。討論：第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：菌液微量移液器第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天⑵稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過0.1ml各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照滴灼冷涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天稀釋涂布法第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？答：應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等。討論第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果分析與評價(jià)

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天微生物的培養(yǎng)基礎(chǔ)知識實(shí)驗(yàn)操作結(jié)果分析與評價(jià)培養(yǎng)基定義：分類：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基無菌技術(shù)培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法定義：消毒與滅菌常用滅菌方法制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌(平板劃線法和稀釋涂布平板法）課堂小結(jié)第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天1.干燥、真空包裝、冷藏冷凍等。這些方法抑制微生物生長需要的水、空氣、適宜的溫度等來阻止其生長。2.這三種培養(yǎng)技術(shù)都需要為培養(yǎng)物提供充足的營養(yǎng)，但無土栽培技術(shù)的操作并不需要保證無菌的條件，而其他兩種技術(shù)都要求嚴(yán)格的無菌條件。習(xí)題答案第49頁,共56頁，2024年2月25日，星期天3.正是由于證明了微生物不是自發(fā)產(chǎn)生的，微生物學(xué)才可能發(fā)展成為一門自立的學(xué)科；巴斯德實(shí)驗(yàn)中用到的加熱滅菌的方法到這了有效的滅菌方法的出現(xiàn)，而這一滅菌原理也適用于食品的保存。第50頁,共56頁，2024年2月25日，星期天【例1】

培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實(shí)驗(yàn)操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌、消毒方法依次是 ()。 ①化學(xué)消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線滅菌⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法 A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤深度剖析培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)皿能耐高溫，需用干熱滅菌；接種環(huán)可用灼燒滅菌達(dá)到迅速徹底的滅菌效果；實(shí)驗(yàn)操作者的雙手可用化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養(yǎng)成分可采用巴氏消毒法。答案A第51頁,共56頁，2024年2月25日，星期天[例3]

除平板劃線法與稀釋涂布平板法外，還有哪些接種方法？微生物接種技術(shù)中最核心的內(nèi)容是什么？提示微生物接種方法還有斜面接種及穿刺接種等方法，所有微生物接種方法中最核心的內(nèi)容是“防止雜菌污染，保證培養(yǎng)物的純度”。第52頁,共56頁，2024年2月25日，星期天【例4】

下列有關(guān)平板劃線操作的敘述不正確的是 ()。 A．第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物 B．每次劃線前，灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種 C．在第二區(qū)域內(nèi)劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于菌液 D．劃線結(jié)束后，灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者第53頁,共56頁，2024年2月25日，星期天解析平板劃線操作中，接種環(huán)取菌種前灼燒的目的是避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物，以后每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線后