急性低氧暴露對棕色田鼠腦組織p53基因表達(dá)的影響

急性低氧暴露對棕色田鼠腦組織p53基因表達(dá)的影響地下鼠(subterraneanrodents)除了耐低氧(hypoxia)、高二氧化碳(carbondioxide)和對黑暗環(huán)境(darkenvironment)的適應(yīng)等特性外,大多還具有抗腫瘤的特性,例如,裸鼴鼠(Heterocephalusglaber)和盲鼴形鼠(Spalax)均具有很強(qiáng)的腫瘤抑制(tumorsuppressor)特性。有關(guān)地下鼠抗腫瘤的分子生物學(xué)研究,主要集中于腫瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)p53及其調(diào)控的分子通路方面。p53基因可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯(cellcyclearrest),并修復(fù)受損的DNA或促進(jìn)細(xì)胞凋亡(apoptosis)。無論DNA修復(fù)還是細(xì)胞凋亡,均可降低低氧對地下鼠重要組織(例如腦組織)的傷害。上述兩條通路被認(rèn)為是地下鼠腫瘤抑制的分子調(diào)控通路,受低氧或者DNA損傷的誘導(dǎo)。本論文通過在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及分子生物學(xué)方面,采用比較生物學(xué)方法,以棕色田鼠(Lasiopodomysmandarinus)為實(shí)驗(yàn)動物,布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)為實(shí)驗(yàn)對照,確定個性化與體重變化的關(guān)系、腦組織海馬區(qū)CA1區(qū)域細(xì)胞凋亡和腫瘤抑制基因p53和HIF-1a的表達(dá)情況,旨在探索棕色田鼠腫瘤抑制的分子生物學(xué)機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.急性低氧暴露后復(fù)氧對體重變化的影響采用視頻自動分析軟件Smart3.0,測定24只棕色田鼠和24只布氏田鼠的個性化(personality),選擇其中個性化得分在0.2-0.6的24只個體(棕色田鼠和布氏田鼠各12只)作為實(shí)驗(yàn)動物,用于復(fù)氧后體重變化的實(shí)驗(yàn)?？芍貜?fù)測量的雙因素方差分析(repeatedmeasurementsANOVA)結(jié)果表明,1)無論是在低氧還是在常氧處理下,棕色田鼠和布氏田鼠的體重變化趨勢相似。即棕色田鼠低氧組、棕色田鼠常氧組、布氏田鼠低氧組、布氏田鼠常氧組等4組動物的體重均呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)的現(xiàn)象(P=0.015),低氧暴露顯著地降低了兩種鼠的體重(P=0.038),而鼠種之間(P=0.956)或者鼠種與低氧處理間的交互作用(P=0.394)則均不顯著。2)棕色田鼠和布氏田鼠的體重變化與其個性化得分間相關(guān)性不顯著(棕色田鼠:y=3.5195x-11.672,R2=0.0373,P=0.71;布氏田鼠:y=0.6768x-8.3354,R2=0.0041,P=0.91),說明實(shí)驗(yàn)中選擇動物的個性化范圍較好,低氧處理對兩種鼠的作用強(qiáng)度相近,能夠很好用于后續(xù)組織學(xué)和分子生物學(xué)的研究。2.急性低氧暴露后復(fù)氧對p53和HIF-1α基因表達(dá)的影響通過提取18只棕色田鼠和18只布氏田鼠腦組織總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA、獲取序列、設(shè)計引物、引物驗(yàn)證、與相近物種多序列比對、構(gòu)建進(jìn)化樹,以及對物種間HIF-1α和p53的表達(dá)量比較,并且應(yīng)用相對定量法,以β-actin為管家基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。雙因素方差分析結(jié)果表明,1)不同復(fù)氧時間對棕色田鼠和布氏田鼠的HIF-1α表達(dá)量的影響達(dá)到極顯著差異(P<0.01),兩種鼠的HIF-1α表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后波動下降恢復(fù)的現(xiàn)象。鼠種和不同復(fù)氧時間的交互作用達(dá)到極顯著差異(P=0.002),鼠種之間的HIF-1α表達(dá)量達(dá)到極顯著差異(P=0.003)。2)棕色田鼠HIF-1α出現(xiàn)的時間晚于布氏田鼠,兩種鼠HIF-1α表達(dá)量在復(fù)氧12h達(dá)到高峰,說明低氧暴露后布氏田鼠腦組織較快呈現(xiàn)缺氧狀態(tài),兩鼠均在復(fù)氧12h時腦組織表現(xiàn)為高度缺氧。3)不同復(fù)氧時間對棕色田鼠和布氏田鼠的p53表達(dá)量的影響達(dá)到極顯著差異(P<0.01),棕色田鼠的p53表達(dá)量先呈上升趨勢,在復(fù)氧12h時p53表達(dá)量達(dá)到高峰,然后呈下降趨勢,而布氏田鼠p53表達(dá)量在整體上沒有變化趨勢。鼠種和不同復(fù)氧時間的交互作用達(dá)到極顯著差異(P<0.01),鼠種之間無顯著差異(P=0.996)。4)棕色田鼠HIF-1α表達(dá)量與p53表達(dá)量之間存在極顯著的正線性關(guān)系(r=0.836,P<0.01),說明腦內(nèi)缺氧可以誘導(dǎo)p53的表達(dá)。3.急性低氧暴露后復(fù)氧對海馬區(qū)CA1細(xì)胞的影響選擇18只棕色田鼠和18只布氏田鼠作為實(shí)驗(yàn)動物,采用TUNEL法染色、倒置顯微鏡觀察,選用腦組織海馬區(qū)CA1區(qū)域做石蠟切片,并在40×10的放大倍數(shù)下,對凋亡細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。雙因素方差分析結(jié)果表明,1)不同復(fù)氧時間對棕色田鼠和布氏田鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響達(dá)到極顯著差異(P<0.01),棕色田鼠和布氏田鼠的凋亡細(xì)胞均呈現(xiàn)先上升后下降恢復(fù)的現(xiàn)象。鼠種和不同復(fù)氧時間之間的交互作用達(dá)到極顯著差異(P<0.01),但是鼠種之間未有顯著差異(P=0.898)。2)棕色田鼠凋亡指數(shù)在復(fù)氧24h達(dá)到高峰,布氏田鼠凋亡指數(shù)在復(fù)氧12h達(dá)到高峰,說明棕色田鼠凋亡高峰出現(xiàn)的時間晚于布氏田鼠,低氧脅迫對布氏田鼠的影響較早,損傷時間較早。3)棕色田鼠HIF-1α和凋亡細(xì)胞呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=