載體與宿主的選擇

關(guān)于載體與宿主的選擇第一節(jié)用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征真核細(xì)胞的克隆載體第2頁,共84頁，2024年2月25日，星期天1載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第3頁,共84頁，2024年2月25日，星期天載體應(yīng)具備的條件具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）

具有合適的篩選標(biāo)記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)第4頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2質(zhì)粒2.1質(zhì)粒的定義質(zhì)粒（Plasmid）：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。第5頁,共84頁，2024年2月25日，星期天雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（SC構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）線狀雙螺旋（L構(gòu)型）大腸桿菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（大腸桿菌致育因子）、Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）、降解質(zhì)粒等。隱蔽性質(zhì)粒多表型質(zhì)粒第6頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.2質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質(zhì)粒廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中，在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，少量線型或RNA質(zhì)粒。絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA）質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb第7頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.2.1質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝（stringentplasmid）松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝（relaxedplasmid）不同類型質(zhì)粒其本質(zhì)是是否受宿主細(xì)胞不穩(wěn)定的復(fù)制起始蛋白控制。即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生長環(huán)境也可能有很大的變化。第8頁,共84頁，2024年2月25日，星期天目前公認(rèn)的用于闡釋質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理的分子模型有兩種：其一是自體阻遏蛋白質(zhì)模型（autorepressormodel），其二是抑制蛋白質(zhì)稀釋模型（inhibitordilutionmodel）。前者的核心內(nèi)容是，阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋（negativefeedback）機(jī)理調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。后者的關(guān)鍵論點(diǎn)是，阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。第9頁,共84頁，2024年2月25日，星期天（1）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型它認(rèn)為質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是受一種由質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)Cop調(diào)控的。細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比，它抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑：一種是通過同質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)（oir）結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒DNA的復(fù)制；另一種是通過阻斷起始蛋白質(zhì)Rep的合成，間接地抑制質(zhì)粒DNA的合成。第10頁,共84頁，2024年2月25日，星期天（2）自體阻遏蛋白質(zhì)模型在抑制蛋白質(zhì)稀釋模型提出若干年之后，L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一種解釋質(zhì)粒DNA復(fù)制機(jī)理的自體阻遏蛋白質(zhì)模型。這個(gè)模型對質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理有兩種解釋：

1.質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的。Rep蛋白質(zhì)編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個(gè)操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個(gè)mRNA分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟勸子-操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Arr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平。而后，由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，則是通過同復(fù)制起點(diǎn)（ori）的結(jié)合，來引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制[圖（a）]。

2.Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)。它既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；同時(shí)又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對復(fù)制起點(diǎn)（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制[圖（b）]第11頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.2.2質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容第12頁,共84頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢。兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。第13頁,共84頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.2.3質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由bom和mob基因決定.第15頁,共84頁，2024年2月25日，星期天接合型質(zhì)粒分子量大嚴(yán)緊型復(fù)制

非接合型質(zhì)粒分子量小松弛型復(fù)制

在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：第16頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.2.4攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第17頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.3質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第18頁,共84頁，2024年2月25日，星期天氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第19頁,共84頁，2024年2月25日，星期天堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第20頁,共84頁，2024年2月25日，星期天堿變性法質(zhì)粒提取的原理：

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在pH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會被變性。

通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。第21頁,共84頁，2024年2月25日，星期天沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA第22頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.4質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr第23頁,共84頁，2024年2月25日，星期天載體改造和構(gòu)建的原則⑴去掉不必要的DNA區(qū)段。⑵減少限制酶的識別位點(diǎn)，一種酶只保留一個(gè)。（單一的限制性酶切位點(diǎn)）。⑶加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。⑷對質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。⑸改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。第24頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.5質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測序質(zhì)粒含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒裝有報(bào)告基因便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選第25頁,共84頁，2024年2月25日，星期天2.6重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制2.6.1pBR322質(zhì)粒載體氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆P49-53pSC101pSE2124pMB1第26頁,共84頁，2024年2月25日，星期天重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體2.6.2pUC18/19拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’P53-54第27頁,共84頁，2024年2月25日，星期天重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galIPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能被β-半乳糖苷酶降解）第28頁,共84頁，2024年2月25日，星期天重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體2.6.3pGEM-3Z多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等P55-56第29頁,共84頁，2024年2月25日，星期天穿梭質(zhì)粒載體：人工構(gòu)建的具有2種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，在2種寄主內(nèi)都能存活和復(fù)制，并可攜帶外源基因往返穿梭的質(zhì)粒載體大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體如pBE2大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體如pPIC9K大腸桿菌-動(dòng)物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體如pMT2p562.6.4穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-植物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體如Ti質(zhì)粒第30頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增第31頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.1大腸桿菌的l噬菌體3.1.1l噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因第32頁,共84頁，2024年2月25日，星期天l噬菌體生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA第33頁,共84頁，2024年2月25日，星期天l噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解第34頁,共84頁，2024年2月25日，星期天l噬菌體生物學(xué)特性：

感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA第35頁,共84頁，2024年2月25日，星期天l噬菌體生物學(xué)特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶原狀態(tài)DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)第36頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.1.2l-DNA載體的構(gòu)建：野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體DNA大小是野生噬菌體的75-105%(37-51kb)，才能被包裝成噬菌體（1）縮短長度第37頁,共84頁，2024年2月25日，星期天l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）第38頁,共84頁，2024年2月25日，星期天l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（36–51）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb第39頁,共84頁，2024年2月25日，星期天（2）刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)第40頁,共84頁，2024年2月25日，星期天（3）加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記第41頁,共84頁，2024年2月25日，星期天加裝選擇標(biāo)記

imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑第42頁,共84頁，2024年2月25日，星期天加裝選擇標(biāo)記

lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑第43頁,共84頁，2024年2月25日，星期天構(gòu)建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株第44頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.1.3l-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑第45頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.1.4l-DNA重組分子的體外包裝l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的第46頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.1.5l-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒

密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

第47頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.1.6l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)

外源基因第48頁,共84頁，2024年2月25日，星期天3.2大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長

第49頁,共84頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第50頁,共84頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的構(gòu)建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker第51頁,共84頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb第52頁,共84頁，2024年2月25日，星期天與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。第53頁,共84頁，2024年2月25日，星期天4考斯質(zhì)粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第54頁,共84頁，2024年2月25日，星期天4.1考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIcossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kb第55頁,共84頁，2024年2月25日，星期天考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞第56頁,共84頁，2024年2月25日，星期天4.2噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA第57頁,共84頁，2024年2月25日，星期天噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個(gè)拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-IGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA第58頁,共84頁，2024年2月25日，星期天噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄第59頁,共84頁，2024年2月25日，星期天5人造染色體載體

人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）第60頁,共84頁，2024年2月25日，星期天5.1細(xì)菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300

kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫第61頁,共84頁，2024年2月25日，星期天oriS,repE-F

forplasmidreplicationandregulationofcopynumber.parAandparB

forpartitioningFplasmidDNAtodaughtercellsduringdivisionandensuresstablemaintenanceoftheBAC.Aselectablemarkersforantibioticresistance,someBACsalsohavelacZatthecloningsiteforblue/whiteselection.T7&Sp6

phagepromotersfortranscriptionofinsertedgenes.第62頁,共84頁，2024年2月25日，星期天5.2酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構(gòu)建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制子

酵母染色體的著絲粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350-400kb第63頁,共84頁，2024年2月25日，星期天酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體第64頁,共84頁，2024年2月25日，星期天第65頁,共84頁，2024年2月25日，星期天插入大小質(zhì)粒載體0-3kλ噬菌體載體0-10k或10-25kM13噬菌體載體1.5k粘粒載體20-45k人工染色體50-400k第66頁,共84頁，2024年2月25日，星期天6真核細(xì)胞的克隆載體6.1酵母細(xì)胞中基因克隆常用載體共同特點(diǎn)（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標(biāo)記；（3）含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便外源基因的插入。共有三種類型的載體

1.整合型載體（YIP）

2.復(fù)制型載體（YRP）

3.附加體型載體（YEP）第67頁,共84頁，2024年2月25日，星期天YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的。如Pyeleu10是由ColEI質(zhì)粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構(gòu)成，在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。YIP型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector）.穿梭載體在基因工程中廣泛使用。YRP型載體轉(zhuǎn)化率高，拷貝也高，但不穩(wěn)定，易丟失YEP型載體一般由大腸桿菌質(zhì)粒、2μm質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。2μm質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)（Ori）和STB區(qū),STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。利用2μm質(zhì)粒，人們已經(jīng)構(gòu)建出許多YEP型載體。YEP型載體對酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性，一般為103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA。比YRP型載體更穩(wěn)定，拷貝數(shù)也高（25-100個(gè)/細(xì)胞），是基因克隆中的常用載體。

第68頁,共84頁，2024年2月25日，星期天6.2植物基因克隆的載體——Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒存在于能夠引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中。這種腫瘤的形成是由Ti質(zhì)粒決定的，故稱為誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒（Tumorinducingplasmid），簡稱Ti質(zhì)粒。第69頁,共84頁，2024年2月25日，星期天T-DNA的染色體整合機(jī)制農(nóng)桿菌介導(dǎo)法第70頁,共84頁，2024年2月25日，星期天共整合轉(zhuǎn)化程序第71頁,共84頁，2024年2月25日，星期天二元整合轉(zhuǎn)化程序第72頁,共84頁，2024年2月25日，星期天6.3動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體:SV40病毒載體SV40病毒（猿猴空泡病毒40）呈小型20面體，環(huán)狀DNA，外殼蛋白由VP1、VP2、VP3構(gòu)成。受納細(xì)胞（permissivecell）：能使細(xì)胞裂解釋放感染性病毒顆粒，并使寄主細(xì)胞裂解，如猿猴細(xì)胞

。非受納細(xì)胞（nonpermissivecell）：不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，但能整合到細(xì)胞染色體中產(chǎn)生癌變，如小鼠或倉鼠的細(xì)胞

。SV40病毒載體1.取代型重組病毒載體2.重組的病毒-質(zhì)粒載體第73頁,共84頁，2024年2月25日，星期天取代型的重組病毒載體（recombinantVirusVector）,其特點(diǎn)是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，這樣形成的重組體DNA能夠在哺乳動(dòng)物的受納細(xì)胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補(bǔ)充被取代的病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補(bǔ)的輔助病毒。①晚期區(qū)段取代載體②早期區(qū)段取代載體第74頁,共84頁，2024年2月25日，星期天重組的病毒-質(zhì)粒載體