酵母菌的形態(tài)觀察大小測定和直接計數(shù)

關(guān)于酵母菌的形態(tài)觀察大小測定和直接計數(shù)

目的要求：

1、觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖，學習區(qū)分酵母菌

死活細胞的實驗方法。

2、學習并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。

3、掌握使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天1、基本原理：酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，大多數(shù)酵母菌以出芽方式進行無性繁殖，有性繁殖通過接合產(chǎn)生子囊孢子。美藍是一種無毒性的染料。它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此酵母活細胞是無色的，而死細胞或衰老細胞則呈藍色或淡藍色，以此進行鑒別。一、.酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天美藍浸片的觀察：（1）在載玻片中央加一滴0.05%呂氏堿性美藍染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均勻。（2）加蓋玻片。注：不要產(chǎn)生氣泡。（3）將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死、活細胞。2、操作技術(shù)第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（4）染色約0.5h后再次進行觀察，注意死細胞數(shù)量是否增加。（5）繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征，并計算0.5h后酵母菌的死亡率。

第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天酵母菌第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天1、基本原理

微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測定需借助測微尺---目鏡測微尺和鏡臺測微尺。二.微生物大小的測定第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

鏡臺測微尺：

是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將1mm等分為100小格，每格長0.01mm。用于校正目鏡測微尺每格的相對長度。

目鏡測微尺：

是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，測量時，需要將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物象。

第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格代表的實際長度也不一樣。因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺進行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度，然后根據(jù)微生物細胞相當于目鏡測微尺的格數(shù)，計算出細胞的實際大小。球菌用直徑來表示其大小；桿菌則用寬和長的范圍來表示。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（1）裝目鏡測微尺(換目鏡)把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的格板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測微尺：1）放鏡臺測微尺：將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。2.操作技術(shù)第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天2）校正：先用低倍鏡觀察，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當清晰地看到鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍鏡進行校正，測出在高倍鏡下，兩重合線之間兩尺所占的格數(shù)。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天3）計算：目鏡測微尺每格長度（um）=兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)x10/兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)（3）菌體大小測定：目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上酵母菌染色制片。先在低倍鏡下找到標本，換高倍鏡測定酵母菌的寬度和長度。測定時，通過轉(zhuǎn)動目鏡測微尺和移動載玻片，測出酵母菌的直徑或?qū)捄烷L所占目鏡測微尺的格數(shù)。最后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺（在高倍鏡下）每格所代表的長度，即為該菌的實際大小。（4）測定完畢：取出目鏡測微尺后，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦試干凈，放回盒內(nèi)保存。第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天1、基本原理顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、Peteroff-Hauser計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。二、顯微鏡直接計數(shù)法第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上有四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天計數(shù)室規(guī)格：

25（中格）×16（小格）

16（中格）×25（小格）每種規(guī)格計數(shù)室中的小方格都是400個。計數(shù)室大?。?/p>

每一個大方格邊長為1mm，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3。第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天25X1616X25第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（1）菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當?shù)木鷳乙?。?）鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。（3）加樣品將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將要搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。2、操作步驟第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（4）顯微鏡計數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，否則視野中不易看清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天由此處注入第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天每一中方格的周圍皆有三條邊線，計算單一中方格的細胞數(shù)時，位于邊線上的細胞計算方式為：以第二條邊線(簡稱中線)為界，接觸到左側(cè)中線與上端中線的細胞要算，接觸到右側(cè)與下端中線的細胞則不列入計算。如上圖，若每一個圓圈皆代表活細胞，空心的要算，而實心的不算。

第23頁,共26頁，2024年2月25日，星期天菌液濃度要適當，一般樣品稀釋度要求每小格約有5~10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格（可選4個角和中央的一個中格）中的菌體進行計數(shù)。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。第24頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（5）清洗血細胞計數(shù)板