谷氨酸生產(chǎn)菌的特征育種及擴大培養(yǎng)

關(guān)于谷氨酸生產(chǎn)菌的特征育種及擴大培養(yǎng)第一節(jié).谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征一、現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類

現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細菌。

1.棒狀桿菌屬(Corynebacterium)直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷分裂形成“八”字形或柵狀排列。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，G+第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2短桿菌屬(Brevibacterium)

短的不分枝直桿菌。多數(shù)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖。G+3小桿菌屬(Microbacterium)

形態(tài)與棒狀桿菌相似。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸弱，主要產(chǎn)乳酸。G+第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium)

培養(yǎng)過程中，細胞形態(tài)變化較大球菌桿菌，桿菌球菌。

G+

G-,G-

G+

能液化明膠，從碳水化合物產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸。第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、谷氨酸棒狀桿菌基因組研究進展谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032GenBankNC-004369第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天目前應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物僅有兩大類:一類為細菌,多采用乳酸菌,另一類為根霉。根霉可以直接利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)L-乳酸,但是產(chǎn)酸量低,副產(chǎn)物多,轉(zhuǎn)化率低。Sauer等構(gòu)建了包含乳桿菌L-乳酸脫氫酶基因的畢氏酵母,它利用木糖發(fā)酵,初始濃度為100g/L，生產(chǎn)L-乳酸達到58g/L，比利用葡萄糖產(chǎn)生乳酸的水平高。基因工程育種（重組DNA技術(shù)）第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、現(xiàn)有谷氨酸生成菌的主要特征（1）細胞形態(tài)球形、棒狀以及短桿狀。（2）G+，無芽孢、無鞭毛，不能運動。（3）需氧型、生物素缺陷型微生物。（4）脲酶強陽性（5）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠。（6）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時發(fā)生細胞膜滲透性的變化。（7）CO2固定反應(yīng)酶系活力強。第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天（8）異檸檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循環(huán)弱。（9）α-酮戊二酸氧化能力微弱。（10）NADPH2進入呼吸鏈能力弱。（11）檸檬酸合成酶、烏頭酸梅、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強。（12）能利用醋酸，不能利用石蠟。（13）具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力。（14）不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5%以上。第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較1、形態(tài)特征短桿至小棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。單個、成對及“V”字形排列。

G+。胞內(nèi)有橫隔。不運動。無芽孢。一、北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，24h白色，48h淡黃色，中央隆起，表面濕潤、光滑，有光澤，邊緣整齊且呈半透明狀，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3、生理特征★對氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，41℃生長較弱?！飌H的影響：Ph5~10均能生長，最適pH6~7.5?！镞€原硝酸鹽：反映強烈。★石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锊凰獾矸?，不分解纖維素。★對尿素的耐力，2.6%以上生長受抑制?！镫迕冈囼灒簭婈栃苑磻?yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖迅速產(chǎn)酸?！锷L因素試驗：生物素是必需生長因素。硫胺素明顯促生長。第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征1、形態(tài)特征短桿至棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。單個、成對及“V”字形排列。折斷分裂。

G+。胞內(nèi)有橫隔。不運動。無芽孢。第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、培養(yǎng)特征普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，近草黃色，表面濕潤、光滑，無光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天★對氧的要求：兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株20~37℃培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，42℃不生長?！飌H的影響：pH6~9生長良好，pH10生長微弱，pH4~5已不能生長?！镞€原硝酸鹽：反映強烈。★石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產(chǎn)堿?！锼獾矸郏环纸饫w維素?！飳δ蛩氐哪土?，2.6%以上生長受抑制?！镫迕冈囼灒簭婈栃苑磻?yīng)?！锂a(chǎn)酸物質(zhì)的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈等迅速產(chǎn)酸?！锷L因素試驗：生物素是必需生長因子。3、生理特征第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征典型的短桿狀，有時微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。單個、成對及“V”字形排列。折斷分裂。

G+。不運動。無芽孢。1、形態(tài)特征第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂平板：菌落圓形，淺黃色，表面濕潤、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無黏性，不產(chǎn)生水溶性色素。第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3、生理特征★對氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關(guān)系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長良好，75℃處理10min不再生長。★pH的影響：pH6~10生長良好，pH5生長微弱，pH4和pH11已不能生長?！镞€原硝酸鹽：反映強烈?！锊凰獾矸?，不分解纖維素?！飳δ蛩氐哪土?，5%以上生長受抑制。★脲酶試驗：強陽性反應(yīng)。★產(chǎn)酸物質(zhì)的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長因素試驗：生物素是必需生長因子。硫胺素是促生長作用。第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天四、北京棒桿菌(7338)與鈍齒棒桿菌(B9)的比較后提取容易，收率較高，質(zhì)量較好分泌色素較多第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2.5天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較

T613感染噬菌體時，不能換用B9，調(diào)換7338.第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化

斜面和一、二級種子在不同培養(yǎng)條件下，細胞形態(tài)基本相似。斜面培養(yǎng)的菌體較細小,一、二級種子比斜面菌體大而粗壯,革蘭氏染色深。多為短桿至棒桿狀,有的微呈彎曲狀,兩端鈍圓,無分枝;細胞排列呈單個、成對及“V”字形,有柵狀或不規(guī)則聚塊;分裂的細胞大小為0.7～0.9*1.0～3.4um。由于生物素充足,繁殖的菌體細胞均為谷氨酸非積累型細胞。一、種子的菌體形態(tài)第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)

長菌型細胞：發(fā)酵0-8h或0-10h。短桿至棒狀，有的微彎曲狀，細胞單個、成對及V字形排列。轉(zhuǎn)移期細胞：發(fā)酵8-18h或10-20h。細胞開始伸長、膨大。在生物素貧乏的條件下，從谷氨酸非積累型轉(zhuǎn)變成谷氨酸積累型。轉(zhuǎn)移期有長菌型細胞，也有產(chǎn)酸型細胞。第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)酸型細胞：發(fā)酵16-20h后。細胞為含磷脂不足的異常狀態(tài)，呈伸長、膨大、不規(guī)則狀，缺乏V字形排列。發(fā)酵后期，細胞較長，呈有明顯的橫隔的多節(jié)細胞，產(chǎn)酸高。過量生物素，不同階段的細胞形態(tài)則基本上沒有明顯的變化。菌體較粗壯，類似于長菌型細胞。典型的異常發(fā)酵，長菌體、耗糖快、耗尿素快、發(fā)酵周期短、低酸或不產(chǎn)酸。第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài)

發(fā)酵前期感染噬菌體后,菌體細胞明顯減少,細胞不規(guī)則,發(fā)圓、發(fā)胖,缺乏"Ｖ"字形排列,有明顯的細胞碎片,嚴重時出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng),互相堆在一起,幾乎找不到完整的菌體細胞,類似蛛網(wǎng)或魚翅狀。

第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后,菌體細胞形態(tài)不規(guī)則,邊緣不整齊,有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西,有細胞碎片。第25頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)、谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種一、日常菌種工作

1、定期分純1-2個月分離純化一次第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、小劑量誘變刺激用紫外線（10-20s）處理，可以淘汰生長微弱的菌株，并能激發(fā)溶原性噬菌體，使挑出來的菌產(chǎn)酸高、生長旺盛、無噬菌體感染。第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3、高產(chǎn)菌制作安瓿管育種后分純的高產(chǎn)菌種需保存到安瓿管中，防止菌種變異。第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、選育耐高滲透壓菌種耐高糖突變株選育在含20-30%葡萄糖的平板上生長好的突變株。耐高谷氨酸突變株選育在含15-20%味精的平板上生長好的突變株。耐高糖、高谷氨酸突變株選育在含20%葡萄糖、15%味精的平板上生長好的突變株。第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、選育不分解利用谷氨酸的突變株選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長或生長微弱的突變株。四、選育細胞膜滲透性好的突變株

生物素亞適量吐溫-60青霉素溫度敏感株第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天五、選育強化CO2固定反應(yīng)的突變株六、選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株七、選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到

α-酮戊二酸代謝的突變株八、選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株九、選育強化能量代謝的突變株耐谷氨酸、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物、谷氨酰胺抗性突變株第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌一、應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天鈍齒棒桿菌B9(細胞個體大、易于提??；產(chǎn)酸率低)天津短桿菌TG-866(產(chǎn)酸率高)融合子F263(細胞個體大、產(chǎn)酸率高)第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、應(yīng)用轉(zhuǎn)化法第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天四、應(yīng)用重組DNA技術(shù)第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求一、菌種擴大培養(yǎng)的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、菌種擴大培養(yǎng)的過程第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1、斜面菌種的培養(yǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.25%，酵母膏0.5%，瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細。生長斜面要求：32℃，生長18-24小時，生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2.一級種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃

培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%，F(xiàn)eSO42mg/k,MnSO42mg/kgPH7.0培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基.第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一級種子培養(yǎng)的質(zhì)量要求：

種齡：12hPH：6.4光密度：OD值凈增0.5以上殘?zhí)牵?.5%以下噬菌體檢查：無鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏染色：陽性反應(yīng)。第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3.二級種子培養(yǎng)(種子罐)培養(yǎng)基：水解糖液3%，尿素0.4%，Na2HPO40.3%，玉米漿