蛋白表達及純化

關于蛋白表達及純化Part1:蛋白表達、純化第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天蛋白表達流程目的基因cDNA表達宿主載體設計引物連接轉化誘導表達蛋白純化鑒定保存第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

gene第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Cell-freeBacterialYeastInsectMammalianHost第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天ExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一：大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序,共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質的復性功能缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng)內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質內含有種類繁多的內毒素(endotoxin)第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Vector第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二大腸桿菌表達載體的基本組成一個良好的大腸桿菌表達載體：復制起點(ori)多克隆位點。篩選標記（抗菌素抗性基因、Tag、篩選標記）控制和調節(jié)轉錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細胞中表達,它的編碼結構必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動子有效控制下。第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天可使外源基因高水平表達的最佳啟動子必須具備以下幾個條件1)強啟動子，外源基因的蛋白質的表達量占細胞總蛋白的10%-30%以上2)應能呈現出一種低限的基礎轉錄水平3)應該是誘導型的,能通過簡單的方式,使用廉價的誘導物得以誘導。常用的大腸桿菌表達載體啟動子：

λ噬菌體的PL啟動子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動子色氨酸操縱子trp啟動子

pBR322質粒的beta－內酰胺酶啟動子啟動子第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天終止子a:如果在克隆基因編碼區(qū)的3

末端之后，接上一個有效的轉錄終止子，便能夠阻止轉錄通讀過位于下游另一個啟動子b:如果在啟動子的上游部位放置一個有效的轉錄終止子,那么由該啟動子驅動的克隆基因的轉錄便會被限制在最低本底水平。c:轉錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質產物水平。d:在構建大腸桿菌表達載體時，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現象。e:大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當其后連上一個U而形成四聯核苷酸的情況下,轉譯終止效率便會得到進一步加強第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天轉譯起始序列a:mRNA的5

末端之獨特的結構特征,是決定mRNA轉譯起始效率的主要因素。b:在構建外源基因的高效表達載體時,需認真選擇有效的轉錄起始序列。c:未鑒定出通用有效的轉譯起始序列的保守結構(KOZAKSEQUENCE)第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天篩選標記:其編碼產物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結構(重組質粒)是否已經導入寄主細胞同任何一種目的啟動子連接,其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據。β－半乳糖苷酶基因lacZ熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)Tag-第13頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共52頁，2024年2月25日，星期天目的基因保護堿基內切酶1內切酶2保護堿基第15頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Xgene引物的設計：設計一對特異性引物。上游、下游引物引入酶切位點oligo6RNA提?。篢RNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNAmarker；2：X基因擴增產物圖1.1X基因的RT-PCR擴增產物第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天GenecloningYourdestinationvectorR1R2YourlinearizedvectorX基因R1R2+1.雙酶切目的基因和載體及切膠回收：附件目的基因保護堿基內切酶1內切酶2保護堿基2.連接轉化：附件3.雙酶切鑒定：附件4.測序：附件1：DNAmarker;2：重組質粒pET28-X雙酶切;3：空質粒pET28a雙酶切圖1.3重組質粒pET28-X雙酶切鑒定圖1.4X基因發(fā)生點突變(AGU→AGC)，但為同義突變（Ser）第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Proteinexpression

檢測該重組質粒在BL21中是否能被誘導表達，并確定在不同IPTG濃度和時間蛋白誘導效率的差異。挑單克隆菌落于7ml含有相應抗生素LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中，37C振蕩培養(yǎng)過夜（8-16h）。37C，1mMIPTG終濃度誘導蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接種，37C培養(yǎng)時，細菌生長至OD600＝0.4-0.6約需2h）時加入終濃度為1mM的IPTG。誘導前在37C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導的對照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1mlOD600為0.4的菌加40ulbuffer)加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。根據蛋白分子量大小配置相應濃度的SDS膠。（50KD蛋白10％或12％）誘導3-4h后收集菌液，取1ml樣品，測OD600，10000rpm，1min離心去上清后加入相應體積的2×上樣緩沖液，vortex。將收集的菌液在水中煮5min，上樣10μl，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。取下膠，考馬斯亮藍染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天IPTGinductionEvenintheabsenceofIPTG,thereissomeexpressionofT7RNApolymerasefromthelacUV5promoter.Thedegreeoftoxicitywillvaryfromproteintoprotein.pETsystemmanual,Novagen,11thEdition第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1：蛋白marker；2~9：分別用IPTG誘導表達0、1、2、3、4、6、8、12h。圖1.6X蛋白表達條件：誘導時間優(yōu)化1：0mmol/L；2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L；4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L；6：1.5mmol/L；7：2.5mmol/L；8：3.5mmol/L；9：5.0mmol/L。圖1.5X蛋白表達條件：IPTG濃度優(yōu)化X蛋白在大腸桿菌中表達條件優(yōu)化第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天ProteinPurificationCharacterizefunction,activity,structureUseinassaysRaiseantibodiesmanyotherreasons...第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天GuidelinesforproteinpurificationDefineobjectivesDefinepropertiesoftargetproteinandcriticalcontaminantsMinimizethenumberofstepsUseadifferenttechniqueateachstepDevelopanalyticalassaysAdaptedfrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天BasicschemeofproteinpurificationFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Proteinpreparation,extraction,clarificationCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Proteinisolation,concentration,andstabilizationReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天FractionalprecipitationofproteinsAddPrecipitant,CentrifugationChromatographyPrecipitatecontaminantsPrecipitateproteinofinterestDiscardsupernatant,ResuspendproteinDiscardpelletAddPrecipitant,Centrifugation,Discardsupernatant,Resuspendprotein第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天IntermediatePurificationLiquidchromatography(lowerresolution,lowercost)From:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天AnintroductiontoliquidchromatographyProteinsolutionappliedtoacolumnColumn=solidporousmatrix(stationaryphase)+liquid(mobilephase)ProteinsseparatedbasedondifferinginteractionswithstationaryandmobilephasesMobilephaseconditionscanbeadjustedtoincreaseordecreaseaffinityofproteinforstationaryphase(gradient)第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天SizeexclusionchromatographyBiggerProteinsSmallerProteins第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天AffinityChromatography第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天AffinityChromatographyMostcommonly-usedchromatographytechniqueCanbeusedonproteinwithnaturalligandsOfteninvolvescovalentattachmentofaffinitytagtoproteinBecauseofuniquetag,providesrapid,specificcleanupinonechromatographystep*Canallowforautomationofproteinpurification第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天PopularSmallAffinityTagsTagMatrixElutingAgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,CobaltimidazoleorlowpH5-15HHHHHnativeordenaturing;inexpensiveresinFLAGanti-FLAGantibodylowpHorEDTA/EGTA8DYKDDDDKhighspecificity;harshelutioncond.StrepIImodifiedstreptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensiveresinS-peptideS-proteinenzymaticcleavage15KETAAAKFERHMDSdetectionpossible;expensiveresin第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天PopularLargeAffinityTagsTagMatrixElutingAgentSizeNotesMBPamylosemaltose40kDasolubility+secretionenhancer;inexpensiveresinGSTglutathionereducedglutathione26kDainexpensiveresincellulose-bindingdomainscellulosewaterorGd?HCl4-20kDasecretionenhancercalmodulin-bindingpeptidecalmodulinEDTA/EGTA4kDadetectionpossible;expensiveresinHis-patchthioredoxinNi2+-NTA,Talonimidazole11.7kDasolubility+S-Senhancer第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天鎳柱親和層析詳細步驟：附件第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1：空質粒未誘導；2：空質粒IPTG誘導；3：細菌裂解液上清（可溶部分）；4：細菌裂解液沉淀（不可溶部分）；(B)切膠回收1：蛋白marker；2：重組質粒未誘導；3：重組質粒IPTG誘導；4：空白孔；5：純化重組蛋白；

(C)Ni柱親和層析：1-8為依次的蛋白過柱洗脫液圖1.7X蛋白的可溶性分析(A)和純化(B、C)蛋白純化結果1.親和層析柱2.切膠回收（附件）可溶性蛋白or包涵體純化第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天PolishingstepsFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACLiquidchromatography(higherresolution,highercost)第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天BasicschemeofproteinpurificationLiquidchromatography(higherresolution,highercost)Liquidchromatography(lowerresolution,lowercost)ReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionAC第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天TagRemovalNH2–proteintaglinkerDDDDKproteaseconsiderations:effectonstructureeffectonfunctionflexibilityprotein1°sequenceCurrentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteinsProteinExpressionandPurification

Volume48,Issue1,July2006,Pages1-13第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天ProteindetectionmethodsSDSVisualconfirmationWesternblotUVSpectrophotometryAbsorbance@280nmDuemostlytoTrp[Protein]calculatedwithBeer’sLawColorimetricTechniquesColorchangeproportionalto[protein]Bradford,Lowry,BCAJ.S.C.OlsonandJohnMarkwell.

CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.291：未加IPTG誘導的重組質粒；2：IPTG誘導的重組質粒；3：空白孔；4：純化后的重組蛋白圖1.8重組蛋白的Westernblot分析26kDa1243Anti-6×Hisantibody第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天FinalstepsinpurificationCheckpuritybydetectionmethodsConcentrateyourproteinPrecipitationCentriconsSmallcolumnwithhighbindingcapacityChooseastoragebufferandstorageconditionsConsiderintendeduseofproteinStabilizingadditivesFlashfreezeproteinandstoreat-80oCConfirmidentityofpurifiedproteinMassspectrometrysequencingAnalyticalassays第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Helpfulreferencesandguides附件：Protein_Expression_Protocol_3th.docpETsystemmanual,Novagen,11thEditionAmershamBiosciences“Proteinpurificationhandbook.”18-1132-29,EditionAC.GotofollowingURLanddownloadpdfofProteinPurificationHandbook:AffinityPurification:Arnau,J.,Lauritzen,C.,Petersen,G.E.,Pedersen,J.Prot.Expr.Purif.48(2006)1-13.J.S.C.OlsonandJohnMarkwell.CurrentProtocolsinProteinScience(2007)3.4.1-3.4.29第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Part2：抗體制備、應用

第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天單抗制備多抗制備：附件抗體鑒定效價特異性第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天PrincipleofMcAbProduction第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天抗原經FCA或FIA充分乳化后免疫家兔。首次免疫佐劑用FCA，第二、三次用FIA。家兔脊柱兩旁選5點皮下注射，每點注攝0.2ml，間隔后2周選不同點注射，每次免疫的抗原量約

350μg/兔。第三次免疫后10天，耳動脈取血檢測抗體效價。雙相瓊脂擴散實驗效價至少達到1:16；ELISA效價達到105即可放血。最后一次取血采用頸動脈放血。新西蘭兔（附件）第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天圖1.9兔多克隆抗體效價測定-瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗圖1.10