細胞免疫熒光技術(shù)

關(guān)于細胞免疫熒光技術(shù)實驗目的掌握免疫熒光技術(shù)的基本原理熟悉細胞免疫熒光技術(shù)的方法了解在免疫細胞化學技術(shù)中如何獲得好的實驗結(jié)果第2頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗原理原位檢測抗原抗體特異反應(yīng)間接法間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標記的抗抗體激發(fā)光顯示熒光Hela細胞Vinculin第3頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗用品試劑：固定液：4%PFA細胞通透：0.2%TritonX封閉試劑：10%正常山羊血清一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體二抗:AlexaFluor555標記的山羊抗小鼠IgGDAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）PBS洗滌緩沖液：PH7.4材料：Hela細胞細胞培養(yǎng)皿儀器：熒光顯微鏡第4頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟一，細胞制備和細胞固定將細胞鋪在24孔板中將細胞培養(yǎng)至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗滌PBS洗滌第5頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟二，細胞免疫熒光ICC染色0.2%TritonX處理5min封閉室溫30min4℃過夜37℃1-2小時37℃5-10min熒光顯微鏡觀察加入一抗加入二抗加入DAPI復染PBS洗滌PBS洗滌PBS洗滌第6頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗結(jié)果三，觀察

humanHeLacells第7頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗中應(yīng)注意的問題

細胞不要鋪的過密:60-70%防止細胞污染

固定時間不要太長,一般10-30min

TrionX處理時間不宜過長，膜蛋白可不必處理選擇合適的封閉液二抗孵育后,一定要洗干凈必要時用恒溫搖床搖洗第8頁,共17頁，2024年2月25日，星期天

1.免疫熒光技術(shù)

2.免疫酶技術(shù)

3.免疫親和技術(shù)

4.膠體金技術(shù)

標記物

使抗體或抗原抗體復合物在各種顯微鏡下可見的物質(zhì)免疫細胞化學技術(shù)第9頁,共17頁，2024年2月25日，星期天免疫細胞化學技術(shù)注意事項選擇合適的方法材料要留好選擇抗體選擇標記酶封閉液的選擇設(shè)定對照實驗第10頁,共17頁，2024年2月25日，星期天思考題檢測Hela細胞中蛋白A定位情況，思考應(yīng)選擇什么方法，用什么儀器觀察？A第11頁,共17頁，2024年2月25日，星期天疑難解答一，缺乏染色

可能的原因無抗原抗體失效固定不充分過度固定抗原修復無效不兼容的二抗和一抗漏用試劑或未按正確的順序加入試劑相應(yīng)的措施用原位雜交方法檢測蛋白表達按說明書儲存抗體;分裝抗體;避免反復凍融增加固定時間或改用不同的固定劑減少固定時間;抗原修復增加修復時間或更換修復液使用可以與一抗結(jié)合的二抗重復染色并確定使用的試劑和加入的順序第12頁,共17頁，2024年2月25日，星期天二，高背景第13頁,共17頁，2024年2月25日，星期天

可能的原因一抗或二抗的濃度過高一抗和/或二抗與組織的非特異性結(jié)合組織過于干燥試劑粘附在舊的或未制備好的玻片上相應(yīng)的措施預實驗摸索最佳濃度一抗孵育前封閉(最好是二抗來源的血清)在染色過程中避免組織干燥用新鮮制備或購買的玻片進行實驗第14頁,共17頁，2024年2月25日，星期天三，細胞/組織的形態(tài)被破壞第15頁,共17頁，2024年2月25日，星期天

可能的原因抗原修復方法過于劇烈組織切片從玻片上脫落組織切片撕裂或褶皺,切片下有氣泡組織形態(tài)難以分辨組織固定不充分,自發(fā)裂解

相應(yīng)的措施預實驗摸索合適的修復條件增加固定時間;烤片;使用新鮮準備的帶有充足電荷的玻片使用鋒利的刀片;分析時避開受損的區(qū)域切片薄一些;冰凍過程形成冰晶,蔗糖脫水及時固定;增加固定時間;提