化妝品毒理學(xué)試驗(yàn)方法與要求（2021-廣東省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院-劉香梅）

化妝品毒理學(xué)試驗(yàn)

方法與要求劉香梅目錄一、化妝品原料注冊(cè)備案毒理學(xué)資料要求

二、化妝品產(chǎn)品注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目及要求三、毒理學(xué)試驗(yàn)方法介紹

一、原料注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目要求

2021年2月26號(hào)，國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布2021年第31號(hào)文《化妝品新原料注冊(cè)備案資料管理規(guī)定》的公告，2021年5月1日實(shí)施。附件3第三條：毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)相關(guān)資料要求就毒理學(xué)資料分別提出了總體要求和毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目的要求1、根據(jù)申報(bào)注冊(cè)或進(jìn)行備案化妝品新原料的具體情形，選擇適當(dāng)?shù)亩纠韺W(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目，進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，并提供相應(yīng)的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)資料。應(yīng)當(dāng)結(jié)合新原料開展的毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目，在逐項(xiàng)對(duì)每個(gè)毒理學(xué)試驗(yàn)的方法、試驗(yàn)過(guò)程、毒理學(xué)終點(diǎn)等進(jìn)行總結(jié)的基礎(chǔ)上，對(duì)新原料的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)進(jìn)行綜述，并得出安全性評(píng)價(jià)結(jié)果。2、化妝品新原料毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)資料可以是化妝品新原料注冊(cè)人、備案人自行或委托開展的毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目的試驗(yàn)報(bào)告、科學(xué)文獻(xiàn)資料和國(guó)內(nèi)外政府官方網(wǎng)站、國(guó)際組織網(wǎng)站發(fā)布的內(nèi)容?？傮w要求一、原料注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目要求

檢測(cè)項(xiàng)目要求1.急性經(jīng)口或急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)；2.皮膚和眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)；3.皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)；4.皮膚光毒性試驗(yàn)（原料具有紫外線吸收特性需做該項(xiàng)試驗(yàn)）；5.皮膚光變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（原料具有紫外線吸收特性需做該項(xiàng)試驗(yàn)）；6.致突變?cè)囼?yàn)（至少應(yīng)當(dāng)包括一項(xiàng)基因突變?cè)囼?yàn)和一項(xiàng)染色體畸變?cè)囼?yàn)）；7.亞慢性經(jīng)口或經(jīng)皮毒性試驗(yàn)（如果該原料在化妝品中使用經(jīng)口攝入可能性大時(shí)，應(yīng)當(dāng)提供亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)）；8.致畸試驗(yàn)；9.慢性毒性/致癌性結(jié)合試驗(yàn)；10.吸入毒性試驗(yàn)（原料有可能吸入暴露時(shí)須做該項(xiàng)試驗(yàn)）；11.長(zhǎng)期人體試用安全試驗(yàn)；12.根據(jù)原料的特性和用途，需提供其他項(xiàng)目的毒理學(xué)試驗(yàn)資料。(毒代和動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)、透皮試驗(yàn)、免疫毒性測(cè)試等)國(guó)內(nèi)外首次防腐、防曬、染發(fā)、祛斑美白、防脫發(fā)、祛痘、抗皺等功效性原料（1-12）非功效性原料（1-7項(xiàng)）境外3年使用史防腐、防曬、染發(fā)、祛斑美白、防脫發(fā)、祛痘、抗皺等功效性原料（1-7）非功效性原料（1-6項(xiàng)）其他安全食用歷史（2-5）大分子（2、4）一、原料注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目要求

注意生物性原料寡肽、多肽、蛋白質(zhì)1-12項(xiàng)需要增加皮膚吸收/透皮試驗(yàn)和免疫毒性試驗(yàn)納米新原料皮膚吸收/透皮吸收試驗(yàn)1-12項(xiàng)吸入毒性試驗(yàn)二、化妝品注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目及要求

檢驗(yàn)依據(jù)：《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版），毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目共有23個(gè)。2015年12月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于發(fā)布化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）的公告（2015年第268號(hào)）2016年11月，總局關(guān)于將化妝品用化學(xué)原料體外3T3中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法納入化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）的通告（2016年第147號(hào)）2017年8月，總局關(guān)于將化妝品用化學(xué)原料離體皮膚腐蝕性大鼠經(jīng)皮電阻和皮膚光變態(tài)反應(yīng)2個(gè)試驗(yàn)方法納入化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）的通告（2017年第136號(hào)）2019年3月，關(guān)于將化妝品中游離甲醛的檢測(cè)方法等9項(xiàng)檢驗(yàn)方法納入化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）的通告（2019年第12號(hào)）二、化妝品注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目及要求

二、化妝品注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目及要求化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例規(guī)定：化妝品分為特殊化妝品和普通化妝品。用于染發(fā)、燙發(fā)、祛斑美白、防曬、防脫發(fā)的化妝品以及宣稱新功效的化妝品為特殊化妝品。特殊化妝品以外的化妝品為普通化妝品化妝品毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目選擇原則1、產(chǎn)品類別：普通/特殊

2、使用部位：唇部/眼睛/皮膚

3、實(shí)際使用情況:駐留/淋洗化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)工作規(guī)范（2019年第72號(hào)）附1化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)項(xiàng)目要求表1-3.二、化妝品注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目及要求化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)工作規(guī)范（2019年第72號(hào)）附1化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)項(xiàng)目要求表1-4.二、化妝品注冊(cè)備案毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目及要求三、毒理學(xué)試驗(yàn)方法介紹1皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)2急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)3皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)4皮膚光毒性試驗(yàn)5細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)6體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)7體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)1范圍：本規(guī)范規(guī)定了動(dòng)物皮膚刺激性或腐蝕性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測(cè)。2試驗(yàn)?zāi)康模捍_定和評(píng)價(jià)化妝品原料及其產(chǎn)品對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度。3定義3.1皮膚刺激性dermalirritation皮膚涂敷受試物后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。3.2皮膚腐蝕性dermalcorrosion皮膚涂敷受試物后局部引起的不可逆性組織損傷。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)4試驗(yàn)的基本原則將受試物一次或多次涂敷于受試動(dòng)物的皮膚上，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察動(dòng)物皮膚局部刺激作用的程度并進(jìn)行評(píng)分。采用自身對(duì)照，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗(yàn)觀察期限應(yīng)足以評(píng)價(jià)該作用的可逆性或不可逆性。倫理學(xué)終點(diǎn)：動(dòng)物如果在試驗(yàn)的任何階段出現(xiàn)嚴(yán)重抑郁、痛苦的表現(xiàn)，則應(yīng)當(dāng)給予人道地處死。依據(jù)試驗(yàn)情況對(duì)受試物進(jìn)行適當(dāng)評(píng)價(jià)。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)5試驗(yàn)方法5.1受試物液體受試物一般不需稀釋，可直接使用原液。若受試物為固體，應(yīng)將其研磨成細(xì)粉狀，并用水或其他無(wú)刺激性溶劑充分濕潤(rùn)，以保證受試物與皮膚有良好的接觸。使用其他溶劑，應(yīng)考慮到該溶劑對(duì)受試物皮膚刺激性的影響。需稀釋后使用的產(chǎn)品，先進(jìn)行產(chǎn)品原型的皮膚刺激性腐蝕性試驗(yàn)，如果試驗(yàn)結(jié)果顯示中度以上的刺激性，可按使用濃度為受試物再進(jìn)行皮膚刺激性腐蝕性試驗(yàn)。受試物為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿（pH值≤2或≥11.5），可以不再進(jìn)行皮膚刺激試驗(yàn)。此外，若已知受試物有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性，經(jīng)皮LD50

小于200mg/kg體重或在急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)中受試物劑量為2000mg/kg體重仍未出現(xiàn)皮膚刺激性作用，也無(wú)需進(jìn)行急性皮膚刺激性試驗(yàn)。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境多種哺乳動(dòng)物均可被選為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，首選白色家兔。應(yīng)使用成年、健康、皮膚無(wú)損傷的動(dòng)物，雌性和雄性均可，但雌性動(dòng)物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少要用4只，如要澄清某些可疑的反應(yīng)則需增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)3d時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合GB14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境與設(shè)施。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)5.3試驗(yàn)步驟5.3.1試驗(yàn)前約24h，將動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)毛剪掉，去毛范圍左、右各3cm×3cm。將受試物一次(或多次)涂敷于受試動(dòng)物的皮膚上，每次0.5mL（g）。在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察動(dòng)物皮膚局部刺激反應(yīng)（紅斑和水腫）的程度并進(jìn)行評(píng)分。按每天每只動(dòng)物的積分均值判斷受試物的刺激強(qiáng)度。5.3.2急性皮膚刺激性試驗(yàn)：采用封閉試驗(yàn)，敷用時(shí)間為2-4h。試驗(yàn)結(jié)束后用溫水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)5.3.3多次皮膚刺激性試驗(yàn)步驟5.3.1開放式涂抹每天一次，連續(xù)14天，每次約0.5mL(g)。5.3.2從第二天開始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時(shí)后觀察結(jié)果，按表1評(píng)分，對(duì)照區(qū)和試驗(yàn)區(qū)同樣處理。5.4試驗(yàn)評(píng)分5.4.1急性皮膚刺激性試驗(yàn)：于清除受試物后的1、24、48和72h觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，按表1進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)分，以受試動(dòng)物積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)24、48和72h各觀察時(shí)點(diǎn)最高積分均值，判定皮膚刺激強(qiáng)度。觀察時(shí)間的確定應(yīng)足以觀察到可逆或不可逆刺激作用的全過(guò)程，一般不超過(guò)14d。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)5.4.1多次皮膚刺激性試驗(yàn)：多次皮膚刺激試驗(yàn)：開放式涂抹每天一次，連續(xù)14天，每天觀察，評(píng)分。按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分，判斷皮膚刺激強(qiáng)度。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)注意：需稀釋使用的產(chǎn)品，先進(jìn)行產(chǎn)品原型的皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)，如果試驗(yàn)結(jié)果顯示中度以上刺激性，可按使用濃度為受試物再進(jìn)行皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)產(chǎn)品對(duì)皮膚的刺激強(qiáng)度。急性皮膚刺激性試驗(yàn)，非即洗類產(chǎn)品（如香水）封閉4小時(shí)；即洗類產(chǎn)品（如沐浴液洗發(fā)液等）封閉2小時(shí)，如果72小時(shí)皮膚刺激反應(yīng)積分未降至0分，應(yīng)延長(zhǎng)觀察時(shí)間至皮膚刺激反應(yīng)完全恢復(fù)，最長(zhǎng)至14天尚未恢復(fù)，則判定受試物對(duì)皮膚有腐蝕性。皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)其他化妝品，皮膚刺激強(qiáng)度為輕刺激性或輕刺激性以下（積分均值<2.0），可予以通過(guò)。兒童產(chǎn)品和宣稱無(wú)刺激性的產(chǎn)品，皮膚刺激強(qiáng)度為無(wú)刺激性（積分均值<0.5），可予以通過(guò)。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)1范圍本規(guī)范規(guī)定了動(dòng)物急性眼刺激性或腐蝕性試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測(cè)。2試驗(yàn)?zāi)康拇_定和評(píng)價(jià)化妝品原料及其產(chǎn)品對(duì)哺乳動(dòng)物的眼睛是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度。3定義3.1眼睛刺激性eyeirritation眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。3.2眼睛腐蝕性eyecorrosion眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)4試驗(yàn)的基本原則受試物以一次劑量滴入每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一側(cè)眼睛結(jié)膜囊內(nèi)，以未作處理的另一側(cè)眼睛作為自身對(duì)照。在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察對(duì)動(dòng)物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評(píng)分，以此評(píng)價(jià)受試物對(duì)眼睛的刺激作用。觀察期限應(yīng)能足以評(píng)價(jià)刺激效應(yīng)的可逆性或不可逆性。倫理學(xué)終點(diǎn)：動(dòng)物如果在試驗(yàn)的任何階段出現(xiàn)嚴(yán)重抑郁、痛苦的表現(xiàn)，應(yīng)當(dāng)給予人道地處死，依據(jù)試驗(yàn)情況對(duì)受試物進(jìn)行適當(dāng)評(píng)價(jià)。動(dòng)物出現(xiàn)角膜穿孔、角膜潰瘍、角膜4分超過(guò)48h、缺乏光反射超過(guò)72h、結(jié)膜潰瘍、壞疽、腐爛等情況，通常為不可逆損傷的癥狀，也應(yīng)當(dāng)給予人道地處死。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)5試驗(yàn)方法5.1受試物液體受試物直接使用原液，染毒量為0.1mL。若受試物為固體或顆粒狀，應(yīng)將其研磨成細(xì)粉狀，染毒量應(yīng)為體積0.1mL或重量不大于100mg（染毒量應(yīng)進(jìn)行記錄）。受試物為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿（pH值≤2或≥11.5），或已證實(shí)對(duì)皮膚有腐蝕性或強(qiáng)刺激性時(shí)，可以不再進(jìn)行眼刺激性試驗(yàn)。氣溶膠產(chǎn)品需噴至容器中，收集其液體再使用。5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境至少3只家兔。試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)3d時(shí)間。在試驗(yàn)開始前的24h內(nèi)要對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的兩只眼睛進(jìn)行檢查（包括使用熒光素鈉檢查）。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結(jié)膜損傷的動(dòng)物不能用于試驗(yàn)。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)不沖洗試驗(yàn)：將受試物0.1mL（100mg）滴入（或涂入）結(jié)膜囊中，使上、下眼瞼被動(dòng)閉合1秒，24小時(shí)之內(nèi)不沖洗眼睛。30秒沖洗試驗(yàn)：滴入受試物后，眼閉合1秒，至第30秒時(shí)，用足量、流速較快的水流沖洗眼睛30秒。4秒沖洗試驗(yàn)：滴入受試物后，眼閉合1秒，至第4秒時(shí)，用足量、流速較快的水流沖洗眼睛30秒。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)臨床檢查和評(píng)分在滴入受試物后1、24、48、72h以及第4d和第7d對(duì)動(dòng)物眼睛進(jìn)行檢查。如果72h未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，即可終止試驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)累及角膜或有其它眼刺激作用，7d內(nèi)不恢復(fù)者，為確定該損害的可逆性或不可逆性需延長(zhǎng)觀察時(shí)間，一般不超過(guò)21d，并提供第7d、14d、21d的觀察報(bào)告。除了對(duì)角膜、虹膜、結(jié)膜進(jìn)行觀察外，其它損害效應(yīng)均應(yīng)當(dāng)記錄并報(bào)告。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)正常結(jié)膜充血和水腫結(jié)膜充血和水腫角膜損傷急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)：以給受試物后動(dòng)物角膜、虹膜或結(jié)膜各自在24、48、或72h觀察時(shí)點(diǎn)的刺激反應(yīng)的最高積分均值和恢復(fù)時(shí)間評(píng)價(jià)。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)注意易觸及眼睛的非即洗類產(chǎn)品（如眼霜，眼影、面膜），做不沖洗試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示受試物有刺激性，需另選用3只家兔進(jìn)行30秒沖洗試驗(yàn)，評(píng)價(jià)受試物對(duì)眼刺激反應(yīng)分級(jí)。即洗類產(chǎn)品（如洗面奶、沐浴液、洗發(fā)液）只做30s沖洗試驗(yàn)。染發(fā)劑類產(chǎn)品只做4s沖洗試驗(yàn)。急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)宣稱無(wú)刺激性、“無(wú)淚配方”產(chǎn)品，需為無(wú)刺激性予以通過(guò)。兒童產(chǎn)品，為無(wú)刺激或微刺激性予以通過(guò)。其他化妝品，眼刺激反應(yīng)分級(jí)為輕刺激性或輕刺激性以下，可予以通過(guò)皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)1范圍本規(guī)范規(guī)定了動(dòng)物皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測(cè)。2試驗(yàn)?zāi)康拇_定重復(fù)接觸化妝品及其原料對(duì)哺乳動(dòng)物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其程度。3定義3.1皮膚變態(tài)反應(yīng)（過(guò)敏性接觸性皮炎）skinsensitization，allergiccontactdermatitis是皮膚對(duì)一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應(yīng)。在人類這種反應(yīng)可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動(dòng)物的反應(yīng)不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。3.2誘導(dǎo)接觸inductionexposure指機(jī)體通過(guò)接觸受試物而誘導(dǎo)出過(guò)敏狀態(tài)的試驗(yàn)性暴露。3.3誘導(dǎo)階段inductionperiod指機(jī)體通過(guò)接觸受試物而誘導(dǎo)出過(guò)敏狀態(tài)所需的時(shí)間，一般至少一周。3.4激發(fā)接觸challengeexposure機(jī)體接受誘導(dǎo)暴露后，再次接觸受試物的試驗(yàn)性暴露，以確定皮膚是否會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。4試驗(yàn)的基本原則實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過(guò)多次皮膚涂抹（誘導(dǎo)接觸）或皮內(nèi)注射受試物10d—14d（誘導(dǎo)階段）后，給予激發(fā)劑量的受試物，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并與對(duì)照動(dòng)物比較對(duì)激發(fā)接觸受試物的皮膚反應(yīng)強(qiáng)度。4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境一般選用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性動(dòng)物應(yīng)選用未孕或未曾產(chǎn)仔的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制，需注意補(bǔ)充適量Vc。4.4試驗(yàn)方法可靠性的檢查（陽(yáng)性質(zhì)控）半年開展一次。試驗(yàn)初期，或使用新的動(dòng)物品系時(shí)，需重新開展。局部封閉涂皮法至少有30%動(dòng)物出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng)；皮內(nèi)注射法至少有60%動(dòng)物出現(xiàn)皮膚過(guò)敏反應(yīng)。二硝基氯代苯、肉桂醛、對(duì)氨基苯酸乙酯等。局部封閉涂皮試驗(yàn)（BuehlerTest,BT）動(dòng)物數(shù)：試驗(yàn)組至少20只，對(duì)照組至少10只。劑量水平：誘導(dǎo)接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度。試驗(yàn)濃度水平可以通過(guò)少量動(dòng)物（2—3只）的預(yù)試驗(yàn)獲得。水溶性受試物可用水或用無(wú)刺激性表面活性劑作為賦形劑，其他受試物可用80%乙醇或丙酮等作賦形劑，并設(shè)溶劑對(duì)照。試驗(yàn)步驟：誘導(dǎo)接觸：將受試物約0.2mL（g）涂在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物去毛區(qū)皮膚上，膠布封閉固定6h。第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次。激發(fā)接觸：末次誘導(dǎo)后14—28d，將約0.2mL的受試物涂于豚鼠背部另一側(cè)去毛區(qū)封閉固定6h。激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)。當(dāng)受試物組動(dòng)物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2時(shí)，判為該動(dòng)物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性，按致敏強(qiáng)度分級(jí)表判定受試物致敏強(qiáng)度。如激發(fā)接觸所得結(jié)果仍不能確定，應(yīng)于第一次激發(fā)后一周，給予第二次激發(fā)結(jié)果判定致敏強(qiáng)度為弱致敏性和弱致敏性以下（未見皮膚變態(tài)反應(yīng)）的產(chǎn)品，可予以通過(guò)。皮膚光毒性試驗(yàn)1范圍：本規(guī)范規(guī)定了皮膚光毒性試驗(yàn)的基本原則，要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學(xué)檢測(cè)2試驗(yàn)?zāi)康模涸u(píng)價(jià)化妝品原料及其產(chǎn)品引起皮膚光毒性的可能性。3定義光毒性phototoxicity皮膚一次接觸化學(xué)物質(zhì)后，繼而暴露于紫外線照射下所引發(fā)的一種皮膚毒性反應(yīng)，或者全身應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)后，暴露于紫外線照射下發(fā)生的類似反應(yīng)。4基本原則將一定量受試物涂抹在動(dòng)物背部去毛的皮膚上，經(jīng)一定時(shí)間間隔后暴露于UVA光線下，觀察受試動(dòng)物皮膚反應(yīng)并確定該受試物有否光毒性。皮膚光毒性試驗(yàn)受試物液體受試物直接使用原液。若受試物為固體，應(yīng)將其研磨成細(xì)粉狀并用水或其他溶劑充分濕潤(rùn)，在使用溶劑時(shí)，應(yīng)考慮到溶劑對(duì)受試動(dòng)物皮膚刺激性的影響。對(duì)于產(chǎn)品而言，一般使用原型，所用受試物濃度不能引起皮膚刺激反應(yīng)(可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定)。陽(yáng)性對(duì)照物選用8—甲氧基補(bǔ)骨脂。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件白色家兔或白化豚鼠，選用6只動(dòng)物進(jìn)行正式試驗(yàn)。檢疫期3d—5d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制，需注意補(bǔ)充適量Vc。設(shè)備皮膚光毒檢測(cè)儀（光源320nm—400nm）如含有UVB，其劑量不得超過(guò)0.1J/cm2。皮膚光毒性試驗(yàn)試驗(yàn)步驟按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）結(jié)果評(píng)價(jià)單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和為2或2以上的動(dòng)物數(shù)為1只或1只以上時(shí)，判為受試物具有光毒性。結(jié)果判定具有光毒性的產(chǎn)品，不予通過(guò)。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)1范圍：本規(guī)范確定了細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。2定義細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)bacterialreversemutationassay利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型→原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。

S9經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)3原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。左:溶劑對(duì)照；右:陽(yáng)性物對(duì)照細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)試驗(yàn)條件試驗(yàn)菌株采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合：鼠傷寒沙門氏菌TA1535；鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠傷寒沙門氏菌TA98；鼠傷寒沙門氏菌TA100；鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）；細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)菌株組氨酸缺陷色氨酸缺陷脂多糖屏障缺損氨芐青霉素抗性切除修復(fù)缺損四環(huán)素抗性自發(fā)回變菌落參考數(shù)*Ames實(shí)驗(yàn)室Zeiger實(shí)驗(yàn)室TA97+/+++-90~180*75~200*TA97a+/+++-90~180*75~200*TA98+/+++-30~5020~50TA100+/+++-100~20075~200TA102+/++-+240~320*100~400*TA1535+/+-+-10~355~20TA1537+/+-+-3~155~20WP2uvrA/+/-+-/5~20WP2uvrA（pKM101）/+/++-/100~200注“+”表示需要組氨酸“+”表示需要色氨酸“+”表示具有rfa突變“+”表示具有R因子“+”表示對(duì)于鼠傷寒沙門氏菌具有△uvrB突變，對(duì)于大腸桿菌，具有△uvrA突變“+”表示具有pAQ1質(zhì)粒*在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增。對(duì)于各菌的自發(fā)回變范圍，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報(bào)道相符。菌株鑒定：新獲得的或長(zhǎng)期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表所示。表1試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)劑量設(shè)計(jì)決定受試物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。對(duì)原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿或5μl/皿。對(duì)產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無(wú)殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè)劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)菌株準(zhǔn)備細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定如果受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該受試物判定為致突變陽(yáng)性，（1）呈劑量-反應(yīng)關(guān)系（2）任何一個(gè)劑量條件下，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)并有可重復(fù)性受試物經(jīng)上述五個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無(wú)論在加S9或未加S9條件下為陽(yáng)性，均可報(bào)告該受試物細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)五個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無(wú)論加S9和未加S9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)1范圍：本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。2試驗(yàn)?zāi)康模罕驹囼?yàn)是用于檢測(cè)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變，以評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性3定義結(jié)構(gòu)畸變structuralaberration在細(xì)胞分裂的中期相階段，用顯微鏡檢出的染色體結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為缺失、斷片、互換等。結(jié)構(gòu)畸變可分為以下兩類。染色體型畸變chromosome-typeaberration染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個(gè)染色單體相同位點(diǎn)均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。染色單體型畸變chromatid-typeaberration染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。有絲分裂指數(shù)mitoticindex中期相細(xì)胞數(shù)與所觀察的細(xì)胞總數(shù)之比值；是一項(xiàng)反映細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)4試驗(yàn)基本原則在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂相，隨后收獲細(xì)胞，制片，染色，分析染色體畸變。大部分的致突變劑導(dǎo)致染色單體型畸變，偶有染色體型畸變發(fā)生。雖然多倍體的增加可能預(yù)示著有染色體數(shù)目畸變的可能，但本方法并不適合用于測(cè)定染色體的數(shù)目畸變。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性對(duì)照可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽(yáng)性對(duì)照物，陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復(fù)的陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)外源性活化系統(tǒng)不存在時(shí)，可使用絲裂霉素C(MMC)、甲磺酸甲酯(MMS)）、甲磺酸乙酯(EMS)等；當(dāng)外源性活化系統(tǒng)存在時(shí)，可使用環(huán)磷酰胺、苯并（a）芘等。陰性對(duì)照物：陰性對(duì)照，即僅含和受試物組相同的溶劑，不含受試物，其他處理和受試物組完全相同。此外，如未能證實(shí)所選溶劑不具有致突變性，溶劑對(duì)照與本實(shí)驗(yàn)室空白對(duì)照背景資料有明顯差異，還應(yīng)設(shè)空白對(duì)照體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)細(xì)胞株中國(guó)地鼠肺（CHL）細(xì)胞株或者中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞株（CHO）受試物濃度設(shè)置（1）最高濃度的選擇：決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度以及pH或滲克分子濃度(osmolality)的改變。（2）細(xì)胞毒性的確定：應(yīng)使用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，在活化系統(tǒng)存在或不存在的兩種條件下確定