血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗

關于血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗實驗目的1、掌握電泳法分離蛋白質的原理2、學習醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質的原理和操作方法3、學習蛋白質染色的方法第2頁,共17頁，2024年2月25日，星期天分離蛋白質的方法分離方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電泳法薄膜電泳等電聚焦電泳聚丙烯酰胺電泳離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析第3頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗原理

電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的蛋白質由于具有不同的等電點而帶不同性質的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可對它們進行分離。第4頁,共17頁，2024年2月25日，星期天以蛋白質為例：H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI第5頁,共17頁，2024年2月25日，星期天影響電泳遷移率的因素：

1、內在因素：蛋白所帶凈電荷的性質和電荷的量、蛋白的大小和形狀

2、外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象第6頁,共17頁，2024年2月25日，星期天血清中幾種主要蛋白組分：血清蛋白質等電點分子量占總蛋白的％清蛋白4.64

69,00057～72α1－球蛋白5.00

200,0002～5α2－球蛋白5.06300,000

4～9β－球蛋白5.1290,000～150,000

6.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pI＜pH血清蛋白帶負電荷,在電場中向正極移動第7頁,共17頁，2024年2月25日，星期天醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜作為支持介質醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙酰化為醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一細密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

第8頁,共17頁，2024年2月25日，星期天染色劑一般蛋白質染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色

第9頁,共17頁，2024年2月25日，星期天實驗操作1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇

將醋酸纖維素薄膜浸于緩沖液中約30min后，取醋酸纖維素薄膜放在濾紙中并吸干表面液體。整條薄膜顏色一致而無白色斑點，則表明薄膜質地均勻(實驗中應選擇質地均勻的膜)。2.電泳槽的準備

電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成濾紙橋。第10頁,共17頁，2024年2月25日，星期天3.點樣：

點樣前，將薄膜粗糙面朝上，距一邊1.5cm處用鉛筆劃一條平行線作為點樣標志區(qū)。點樣時，用點樣器毛吸取血清，在薄膜粗糙面上輕而溫和地印一下（蓋章法）。點樣區(qū)距陰極端1.5cm（見圖）。此步是實驗的關鍵。

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖（黑線處為點樣位置）

點樣區(qū)6.5cm1.5cm第11頁,共17頁，2024年2月25日，星期天4.電泳

將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，恒壓110V，打開電源開關，電泳時間60min。電泳后，調節(jié)旋鈕使電壓為零，關閉電泳儀切斷電源。第12頁,共17頁，2024年2月25日，星期天5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min，染色時可置于搖床，均勻搖晃。6.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗3次，每次5min,直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，取出薄膜放在濾紙上，用吹風機冷風吹干或者自然晾干。第13頁,共17頁，2024年2月25日，星期天8.記錄和分析實驗結果

透明后可將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄，并判斷分析結果。透明后的薄膜可作掃描或照相。正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖

1．為清蛋白，2，3，4，5，分別為α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6為點樣原點

第14頁,共17頁，2024年2月25日，星期天注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。2、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，薄膜吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞薄膜或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應點在薄膜的粗糙面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。5、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。6、應控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復染。第15頁,共17頁，2024年2月25