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薄層色譜簡介陳新

2006.08QC基礎技能1薄層色譜簡介QC基礎技能1QC基礎技能

主題一﹑原理二﹑固定相三﹑展開劑四﹑操作方法五﹑定性分析六﹑定量分析七﹑Rf值與化學結構關系2QC基礎技能一﹑原理1﹑薄層色譜法是把吸附劑（或載體）均勻地鋪在一塊玻璃板、鋁箔或塑料板上形成薄層,在此薄層上進行色譜分離,稱為薄層色譜法。待分離的樣品點在薄層的一端，在密閉的容器中，用適宜的流動相或展開劑展開。由于吸附劑對不同的吸附力大小不同，易被吸附的組分移動地慢一些，而較難被吸附的組分流動地快一些。經(jīng)過一段時間的展開，不同的物質彼此分開，最后形成互相分離的斑點。3一﹑原理32﹑將試樣點在色譜濾紙或層析板的一端，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點時，帶動試樣向上運動。3﹑薄層層析流動相的移動是依靠毛細作用。42﹑將試樣點在色譜濾紙或層析板的一端，并將該端浸在作為流動相4﹑比移值（R

)：溶質移動距離與流動相移動距離之比A，B為樣品溶液點樣的位置，如圖1所示：A物質的Rf=;B物質的Rf=;所以Rf值與K之間關系可用下式表示：Rf=原點至溶劑前沿的距離原點至斑點中心的距離=Rf起始線abcAB溶劑前沿圖1、Rf值的測量示意圖acbc11+kVsVm54﹑比移值（R)：原點至溶劑前沿的距離原點至斑點中心的距離

在一定色譜條件下，Rf值為常數(shù)，其值在0~1之間，若某組分Rf=0，表示它不隨展開劑移動，吸附劑對它的吸附力很強，留在原點不動。若Rf=1，表示吸附劑對它基本不吸附，隨著展開劑到達溶劑前沿，K=0。Rf值越小，表示該組分K越大，極性越大。根據(jù)物質的化學結構不同，極性不同，在同一薄板上展開，我們能預測它們的Rf值大小。6

在一定色譜條件下，Rf值為常數(shù)，其值在0~1之間，若某組5、分離度（Rs）衡量分離效果的指標可用分離度Rs表示，其定義為，相鄰兩斑點的斑點中心至原點的距離之差與兩斑點的寬度總和之半的比值，即

如圖2所示：L1L2W1W2圖2、薄層色譜的分離度測定Rs=L2-L1（W1+W2）/27L1L2W1W2圖2、薄層色譜的分離度測定Rs=L2-L1（二、固定相薄層色譜法所用的固定相最常用的是硅膠。粒度要求比柱色譜更細，普通薄層硅膠粒度在40um左右，展開10~15cm。高效薄層色譜硅膠粒度小至10um，5um，展開距離為5cm左右。薄層色譜展開后的斑點一般都比較集中。88三、展開劑

薄層色譜法中選擇展開劑的一般規(guī)則與吸附柱色譜法中選擇流動相的規(guī)則相同。極性大的樣品需用極性較大的展開劑，極性小的樣品用極性小的展開劑。通常先用單一溶劑展開，根據(jù)被分離的物質在薄層上的分離效果，進一步考慮改變展開劑。一般希望Rf值在0.2~0.8之間，如果值較大，斑點都在前沿附近，則應加入適量極性較小的溶劑（如環(huán)己烷，石油醚等）以降低展開劑的極性。9三、展開劑9調節(jié)被測組分的Rf值大小，除可改變展開劑的極性外，還可通過改變板的活度來到達。一般薄層板的活化溫度為105℃，活化1h，若要降低板的活度，可通過降低板的活化溫度如105℃降為80℃、60℃，均可達到降低板的活度目的。在活度小的板上，吸附劑對各組分的吸附力小，而Rf值會升高。10調節(jié)被測組分的Rf值大小，除可改變展開劑的極性外，還可通過改四、操作方法薄層色譜法一般操作程序可分為制板、點樣、展開和顯色4個步驟。11四、操作方法11吸附劑或載體的選擇及薄層的制備薄層的預處理點樣樣品的制備色譜前衍生化薄層板預平衡展開定位定性定量平板色譜法操作流程圖12吸附劑或載體的選擇及薄層的制備薄層的預處理點1、制板

制備薄板所用的玻璃板必須表面光滑、清潔，不然吸附劑不易涂布，同時可能影響分離和檢測；其大小可根據(jù)實際需要自由選擇，小至載玻片，大的用20cm×20cm玻片。薄板可分為加粘合劑的硬板和不加粘合劑的軟板兩種。131、制板13a.軟板的制備將吸附劑撒在玻璃板的一端，另取比玻璃板寬度稍長的玻璃管，在管的兩端各包上橡皮膏，也可以套上塑料管或橡皮管，其厚度即為薄層的厚度。b.硬板的制備硬板即粘合薄層，即在吸附劑中加入粘合劑。常用的粘合劑有羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)和煅石膏(CaSO4·1/2H2O)。14a.軟板的制備14硅膠-CMC-Na板制備：取CMC-Na7.5g加1000mL水，加熱使溶解，放置使澄清。取上清液100mL，分次加入硅膠約33g，調成糊狀。將糊狀的吸附劑倒在清潔的玻璃板上，使均勻流布于整塊玻璃板上，平放自然晾干，105℃活化1h，置干燥器中備用。15硅膠-CMC-Na板制備：取CMC-Na7.5g加10002、點樣將樣品溶于適當溶劑中，盡量避免用水，因為水溶液斑點易擴散，且不易揮發(fā)除去，一般用乙醇、甲醇等有機溶劑。若為液體樣品，可直接點樣。原點直徑為2~4mm，溶液宜分次點加，每次點加后，使其自然干燥，或用電吹風機促其迅速干燥，只有干后，才能點第2次。162、點樣16點樣工具一般采用毛細管或微量注射器，點樣時必須注意勿損傷薄層表面，進行薄層定量時，用毛細管點樣時最好不與薄層直接接觸。點樣量一般以幾微升為宜。17點樣工具一般采用毛細管或微量注射器，點樣時必須注意勿損傷薄層3、展開展開缸一般為長方形密閉玻璃缸，粘合薄層常用上行法展開，將薄層板直立于盛有展開劑的色譜缸中，展開劑浸沒薄板下端的高度不超過0.5cm，薄板上的原點不得浸入展開劑中。待展開劑前沿達一定距離，如10~20cm時，將薄層板取出，在前沿處作標記。使展開劑揮散后，顯色。183、展開18在展開之前，薄層板置于盛有展開劑的色譜缸內飽和15min，此時薄板不與展開劑直接接觸。待色譜缸內，展開劑蒸氣，薄層與缸內大氣達到動態(tài)平衡時，也稱為飽和時，再將薄板浸入展開劑中。這樣操作可以防止邊緣效應。邊緣效應是同一化合物在同一塊板上，因其點樣位置不同，而Rf值不同。處于邊緣的點樣點，其Rf值大于中心點。其原因是由于展開劑在未達飽和的色譜缸內不斷地蒸發(fā)，蒸發(fā)速度從薄層中央到兩邊逐漸增加，使邊緣上升的溶劑較中央多，致使近邊緣溶質的遷移距離比中心處大，導致邊緣的Rf值大。19在展開之前，薄層板置于盛有展開劑的色譜缸內飽和15min，此薄層展開方式除上行法外，還有徑向展開法（薄板為圓形），多次展開法（同一展開劑，重復多次展開），雙向展開法（展開一次后，換90°用另外一種展開劑展開，適用于非常復雜的樣品）。對軟板展開，則多用傾斜上行法。20薄層展開方式除上行法外，還有徑向展開法（薄板為圓形），多次4、顯色顯色方法有下列4種：a.首先在日光下觀察，劃出有色物質的斑點位置。b.在紫外燈（254nm或365nm）下，觀察有無暗斑或熒光斑點，并記錄其顏色，位置及強弱。有熒光的物質或少數(shù)有紫外吸收物質可用此法檢出。214、顯色21c.熒光薄層板檢測，適用于有紫外吸收的物質。熒光薄層是在硅膠中摻少量熒光物質，如硅酸鋅錳，制成的板，在254nm紫外燈下，整個薄層板呈黃色熒光，被測物質由于吸收了部分照射在此斑點位置的紫外線，而呈現(xiàn)各種顏色的暗斑。22c.熒光薄層板檢測，適用于有紫外吸收的物質。熒光薄層是在硅d.既無色，又無紫外吸收的物質可采用顯色劑顯色。用硫酸乙醇液顯色，大部分有機化合物能呈顯不同顏色的斑點。碘蒸氣顯色也是有機化合物良好的顯色劑。其它顯色劑利用物質的特性反應顯色，如氨基酸，可噴茚三酮試劑，多數(shù)氨基酸呈紫色，個別氨基酸呈黃色。對還原性物質，含酚羥基物質，可噴三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑。23d.既無色，又無紫外吸收的物質可采用顯色劑顯色。用硫酸乙醇五、定性分析對斑點的定性鑒別主要依靠Rf值的測定。常采用的方法是用已知標準物質作對照。將樣品與標準點在同一塊薄層上展開，顯色后，根據(jù)樣品的Rf值及顯色過程中的不同現(xiàn)象與標準品對照比較進行定性鑒定。與紫外光譜用于定性時的情況類似，僅根據(jù)一種展開劑展開后得到的Rf值作為定性依據(jù)是不夠的，需要經(jīng)過兩種以上不同組成的展開劑得到的Rf值與標準品一致時，才可基本認定該斑點與標準品是同一化合物。24五、定性分析24六、定量分析薄層色譜法的定量分析采用儀器直接測定較為準確，方便。但一些簡易的方法有利于薄層色譜法的推廣。1.目視比較法