甾體激素類藥物分析

關(guān)于甾體激素類藥物分析第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與分類甾體激素?zé)o論是天然產(chǎn)物還是人工合成品它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上均具有一個(gè)共同的基本母核——環(huán)戊烷駢多氫菲。

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

第2頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天取代基:

對(duì)于大多數(shù)的甾體激素在10、13和17—位上出現(xiàn)取代基。具有如下的碳骨架：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(續(xù))

注意：大多數(shù)的甾體激素并不是均在10—，13—和17—位上出現(xiàn)取代基，對(duì)于不同類型的激素，有些出現(xiàn)一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)取代基。第3頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天

分類

第4頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天在結(jié)構(gòu)上，各種腎上腺皮質(zhì)激素均可以認(rèn)為是皮質(zhì)酮的衍生物。一、腎上腺皮質(zhì)激素

例如，醋酸可的松、地塞米松、潑尼松（強(qiáng)的松）、醋酸去氧皮質(zhì)酮等等。第5頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

皮質(zhì)酮

——醋酸可的松（CortisoneAcetate）第6頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

皮質(zhì)酮

——

地塞米松（Dexamethasone）

第7頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

皮質(zhì)酮

——潑尼松（強(qiáng)的松）（Prednisone）

第8頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

皮質(zhì)酮

——醋酸去氧皮質(zhì)酮

第9頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點(diǎn)可表現(xiàn)為：

基本母核的碳骨架具有21個(gè)碳原子。

A環(huán)有

，

—不飽和酮，即

4-3-酮基。C17位具有

—醇酮基，通常將其酯化以延長(zhǎng)肌注作用時(shí)間。為了增加藥物的水溶性，通常將其制成鈉鹽。

分析檢測(cè)主要基于

4-3-酮基和C17位的

-醇酮基，而C11位的羥基或被氧化后的酮基，由于空間位阻較大，通常難以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。第10頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

醋酸可的松強(qiáng)的松甾體激素第11頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

氫化可的松磷酸鈉

倍他米松磷酸鈉第12頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天腎上腺皮質(zhì)激素（續(xù)）

第13頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在臨床上常用的雄性激素為睪丸素（或稱為睪酮、睪丸酮）的衍生物。例如，甲睪酮（甲基睪丸素）、氟羥甲睪酮等。二、雄性激素及蛋白同化激素

睪丸素甲睪酮丙酸睪酮第14頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天將睪丸素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，使其雄性激素活性大大減弱而蛋白質(zhì)同化作用保留或增強(qiáng)，這類甾體激素藥物即為同化激素。因此，同化激素也具有雄性激素的功能，在結(jié)構(gòu)上具有相似性，往往歸于同一類。雄性激素及蛋白同化激素(續(xù))

睪丸素苯丙酸諾龍第15頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點(diǎn)

雄性激素及蛋白同化激素(續(xù))

基本母核碳骨架：雄性激素19個(gè)碳，蛋白同化激素18個(gè)碳。多數(shù)A環(huán)有

4-3-酮基，C17位無(wú)側(cè)鏈，多數(shù)是一個(gè)羥基。大多數(shù)易溶于油而不溶于水。一般將C17位上的羥基酯化，可延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。對(duì)于該類藥物分析最有意義的基團(tuán)為A環(huán)上的

4-3-酮基、C17-羥基及其酯基。第16頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天雄性激素及蛋白同化激素(續(xù))環(huán)戊丙酸睪丸素癸酸諾龍第17頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天孕激素也稱為黃體激素或孕酮，其典型藥物為黃體酮。臨床上重要的藥物有黃體酮、醋酸甲羥孕酮（安宮黃體酮）、已酸羥孕酮（已酸孕酮）、醋酸甲地孕酮等。三、孕激素本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點(diǎn)：

1、基本母核結(jié)構(gòu):黃體酮21個(gè)碳原子的碳骨架。

2、大多數(shù)A環(huán)具有

4-3-酮基，C17位具有甲酮基，且有些具有

-羥基及其酯。

3、該類藥物分析主要依賴的活性基因?yàn)?/p>

4-3-酮基和C17位的甲酮基。

第18頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天孕激素(續(xù))黃體酮

安宮黃體酮已酸孕酮醋酸甲地孕酮第19頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天雌激素又稱為卵泡激素。臨床上廣泛應(yīng)用的是雌二醇及其各種酯和炔雌醇及其衍生物。四、雌激素本類藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點(diǎn)：

1、基本母核的碳骨架具有18個(gè)碳原子

。

2、A環(huán)為芳香苯環(huán)，C3位上有酚羥基，具有酸性，而有些藥物在此鍵形成酯或醚。C10位上無(wú)角甲基，C17有羥基或酮基，有些還有乙炔基。

3、本類藥物分析的主要活性部位為酚羥基和C17位的羥基和它們的酯鍵、或酮基。

第20頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天雌激素(續(xù))

雌二醇

炔雌醇基本母核第21頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天雌激素(續(xù))苯甲酸雌二醇

炔雌醚第22頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天雌激素(續(xù))雌酮馬烯雌酮第23頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

鑒別試驗(yàn)

甾體激素可供分析鑒定使用的主要基團(tuán)可歸納為四類：

1、在A環(huán)上的

4-3-酮基。

2、C17位上的

-醇酮基、羥基、乙炔基、甲酮基以及17、21—二羥—20—酮基。

3、A環(huán)上的酚羥基。

4、酯基及鹵素。

甾體激素鑒別的常用方法可歸納為：

呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、制備衍生物測(cè)溶點(diǎn)、利用水解產(chǎn)物的特定反應(yīng)、薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜和高效液相色譜（HPLC）等方法。

第24頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)

一、化學(xué)鑒別法1、常用的酸：硫酸、高氯酸、磷酸、鹽酸。其中以硫酸的應(yīng)用最廣。

2、溶劑：硫酸的呈色反應(yīng)中應(yīng)用最廣的試劑為甲醇和乙醇，而稀釋反應(yīng)體系的試劑常為稀硫酸或水。

3、Kober反應(yīng)是最為著名的、反應(yīng)最廣的對(duì)于雌性激素的呈色反應(yīng)。

第25頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)(續(xù))第26頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)(續(xù))

將雌性激素與硫酸—乙醇共熱產(chǎn)生黃色，加水或稀硫酸稀釋后再加熱呈紅色，稱為Kober反應(yīng)。例如，雌二醇的Kober反應(yīng)為兩步反應(yīng):

第一步：雌二醇在60~80%硫酸中加熱。

第二步：冷卻后加水，再加熱。

反應(yīng)體系的紫外—可見(jiàn)吸收光譜明顯地發(fā)生了向長(zhǎng)波方向移動(dòng)（紅移），說(shuō)明光譜吸收能級(jí)差變小，共軛體系形成或加強(qiáng)。

第27頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)(續(xù))第28頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、C17位

—醇酮基的呈色反應(yīng)（二）官能團(tuán)的反應(yīng)

堿性酒石酸酮試液(裴林試劑)、氨制硝酸銀試液（多倫試液）、四氮唑鹽試液。

試劑(氧化劑)

皮質(zhì)激素類藥物C17位上具有

-醇酮基（-CO-CH2OH），表現(xiàn)出還原性，

-醇羥基可以被氧化為醛、或醇酮基發(fā)生斷裂?；驹硭牡螓}試液被還原而發(fā)生呈色反應(yīng)，產(chǎn)物的顏色隨所用試劑條件不同而定，多為紅色或藍(lán)色。

第29頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、酮基的呈色反應(yīng)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(續(xù))

甾體激素分子中，大多在C3和C20位上含有酮基，能與羰基試劑肼發(fā)生呈色反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)腙。

肼

腙

常用的試劑：2,4—二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼。

2,4—二硝基苯肼

異煙肼

反應(yīng)條件：常為酸性催化條件下發(fā)生反應(yīng)，并且常在非水溶劑中進(jìn)行。

第30頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、甲酮基的呈色反應(yīng)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(續(xù))

在甾體激素分子中含有的甲酮基—CO—CH3或活潑的亞甲基能與亞硝基鐵氰化鈉、間二硝基酚、芳香醛反應(yīng)呈色。

與亞硝基鐵氰化鈉的反應(yīng)認(rèn)為是黃體酮的靈敏、專屬的鑒別方法，在一定條件下，黃體酮顯藍(lán)紫色，其中常用甾體激素均顯淡橙色或不顯色。

第31頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、酚羥基的呈色反應(yīng)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(續(xù))

在多數(shù)的雌激素中，C3位上存在酚羥基，能與重氮苯磺酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成紅色偶氮染料?？捎糜趲Х恿u基的雌激素藥物的鑒別。

在弱堿性條件下，重氮鹽與酚偶聯(lián)，重氮基直接攻擊酚羥基的對(duì)位，發(fā)生碳偶聯(lián)。對(duì)位有取代基時(shí)，則偶聯(lián)發(fā)生在鄰位。

第32頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、炔基的沉淀反應(yīng)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(續(xù))

含炔基的甾體激素與硝酸銀試液作用，產(chǎn)生白色的炔化銀沉淀。

例如：雌激素：炔雌醇、炔雌醚、美雌醇。孕激素：炔諾酮、異炔諾酮、甲炔諾酮。

第33頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、鹵素的反應(yīng)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(續(xù))

在甾體激素分子中有時(shí)出現(xiàn)氟或氯取代的藥物,其鹵素鑒別首先需經(jīng)氧瓶燃燒或回流水解將其轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)鹵化物，再按無(wú)機(jī)鹵化物進(jìn)行鑒別。

基本原理方法1、含氟藥物：按中國(guó)藥典“有機(jī)氟化物”項(xiàng)的方法進(jìn)行鑒別。（參見(jiàn)本書(shū)P16）

2、含氯藥物：當(dāng)氯與側(cè)鏈烴相連時(shí)，用回流水解法將氯轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)物；而氯與母核環(huán)結(jié)合時(shí)，則使用氧瓶燃燒法。再按無(wú)機(jī)氯化物進(jìn)行鑒別。（參見(jiàn)本書(shū)P18）第34頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天7、酯的反應(yīng)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(續(xù))

藥物中酯結(jié)構(gòu)的鑒別，一般先水解產(chǎn)生羧酸，再根據(jù)羧酸的性質(zhì)進(jìn)行鑒別。

基本原理羧酸鑒別方法1、利用低級(jí)脂肪酸乙酯的香氣鑒別相應(yīng)的藥物2、利用低級(jí)脂肪酸的特定氣味進(jìn)行鑒別第35頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn)（一）測(cè)定衍生物縮氨基脲的熔點(diǎn)

含有酮基的甾體激素與氨基脲發(fā)生縮合反應(yīng)，生成具有一定熔點(diǎn)的縮氨脲?；谌埸c(diǎn)測(cè)定，可以鑒別相應(yīng)的藥物。

苯丙酸諾龍與鹽酸氨基脲縮合生成縮氨脲，其衍生物熔點(diǎn)約為182

C，且熔融分解。基本原理示例：苯丙酸諾龍的鑒別第36頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定衍生物縮氨基脲的熔點(diǎn)(續(xù))

第37頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）酯的水解

具有酯鍵結(jié)構(gòu)的藥物，可采用酯水解方法制備相應(yīng)的甾體激素母核化合物，基于該化合物所具有的敏銳熔點(diǎn)，鑒別相應(yīng)的含有酯鍵結(jié)構(gòu)的藥物?；驹硎纠罕岵G酮（丙酸睪丸素）的鑒別

丙酸睪酮用醇制氫氧化鉀水解，產(chǎn)生具有敏銳熔點(diǎn)的睪丸素（m.p.150~156

C，多數(shù)情況下為152~156

C）。第38頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天酯的水解(續(xù))

第39頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、紫外分光光度法

甾體激素重要的紫外發(fā)色團(tuán)有兩類：

4-3-酮基和芳環(huán)。它們?cè)谧贤夤鈪^(qū)均有特征吸收，其最大吸收峰前者約為240nm，后者隨芳環(huán)取代基不同而發(fā)生較大變化?；谔卣魑砧b別相應(yīng)的甾體激素?；驹龛b別方法：常采用的方法有以下三種：1、比較最大吸收波長(zhǎng)

max及吸收系數(shù)

max或Amax的一致性。2、比較某兩個(gè)波長(zhǎng)（通常為在出現(xiàn)多個(gè)吸收峰處的波長(zhǎng)）處吸收度比值的一致性。第40頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天紫外分光光度法（續(xù)）3、與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)的譜圖比較其光譜圖的一致性。

例：丙酸倍氯米松乙醇溶液（20

g/ml）的紫外光譜參數(shù)為，

max=239nm，A239nm=0.57~0.60(吸收度)A(239nm)/A(263nm)=2.25~2.45第41頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、紅外分光光度法

在甾體激素的鑒別方法中，紅外光譜由于其強(qiáng)烈的特別性，它已成為了各國(guó)藥典普遍采用的、有效而可靠的一咎手段。鑒別方法：常采用的方法有以下兩種：1、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法：符合于各國(guó)的藥品標(biāo)準(zhǔn)要求，但檢定費(fèi)用增加。2、標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照法：檢定費(fèi)用較低，但有時(shí)由于標(biāo)準(zhǔn)品要求的差異使標(biāo)準(zhǔn)圖譜有所差異，導(dǎo)致各圖的參照標(biāo)準(zhǔn)不同。第42頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天紅外分光光度法（續(xù)）主要振動(dòng)特征峰為：（1）、苯環(huán)1615，1590，1505cm-1。（2）、炔基3300cm-1。（3）、游離酚羥基3610cm-1。（4）、C17—羥基3505cm-1。

第43頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天紅外分光光度法（續(xù)）第44頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、薄層色譜（TLC）法鑒別方法1、樣品制備：供試品經(jīng)預(yù)處理，消除注射液、片劑和膏劑等輔料的干擾。將預(yù)處理的供試品和對(duì)照品分別用規(guī)定的溶劑配制成一定濃度的溶液備用。2、展開(kāi)與檢出：在同一塊薄層板上，用供試品和對(duì)照品的儲(chǔ)備液分別點(diǎn)樣，按規(guī)定的相同條件（薄層板、展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量、展開(kāi)時(shí)間、晾干條件、顯色劑以及檢出方法等）展開(kāi)和檢出。對(duì)于相同的藥品，要求所顯斑點(diǎn)的Rf值應(yīng)相同。第45頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天薄層色譜法（續(xù)）部分甾體激素TLC的鑒別條件第46頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、高效液相色譜（HPLC）法鑒別方法

在相同的色譜條件下，比較甾體激素樣品與其對(duì)照品峰的保留時(shí)間進(jìn)行鑒別。在藥典中，一般都規(guī)定在含量測(cè)定項(xiàng)下的HPLC圖中，供試品與對(duì)照品的保留時(shí)間一致。第47頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

特殊雜質(zhì)檢查

甾體激素藥物的特殊雜質(zhì)主要是生產(chǎn)和貯存過(guò)程中引入,主要包括以下幾個(gè)部分:

1、其它甾體化合物：原料和生產(chǎn)中的中間體、異構(gòu)體以及降解產(chǎn)物等方式收入。2、硒、有機(jī)溶劑、游離磷酸鹽。第48頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、其他甾體的檢查檢查方法

中國(guó)藥典中多數(shù)甾體激素原料藥需作“其他甾體”檢查。由于其他甾體與藥物結(jié)構(gòu)類似，通常采用色譜法進(jìn)行檢查。（一）薄層色譜法基本方法

各國(guó)藥典多采用高低濃度對(duì)比法進(jìn)行檢查，即用供試品溶液的稀釋液作為對(duì)照進(jìn)行檢查。第49頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天其他甾體的檢查（續(xù)）示例：氫化可的松中其他甾體的檢查1、供試品：含本品3.0mg/ml的氯仿-甲醇(9:1)溶液.2、對(duì)照品:用氯仿-甲醇(9:1)稀釋供試品為60g/ml.3、檢視:供試品溶液的雜質(zhì)斑點(diǎn)不得超過(guò)3個(gè),且其顏色不得深于對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn).（二）高效液相色譜法基本方法

多采用與含量測(cè)定相同條件下的其他甾體檢查，且多為主成分自身對(duì)照法，即采用供試品溶液的稀釋液作為對(duì)照，以其主峰作為參比。第50頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天其他甾體的檢查（續(xù)）示例：黃體酮中其他甾體的檢查1、供試品：含本品1.0mg/ml的甲醇溶液.2、對(duì)照品:含本品0.02mg/ml的甲醇溶液.3、比較標(biāo)準(zhǔn):供試品溶液的雜質(zhì)峰不得超過(guò)1個(gè),且其面積不得大于對(duì)照品溶液主峰的3/4.第51頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、硒的檢查檢查方法“雜質(zhì)硒”主要來(lái)源于有些生產(chǎn)的后工序中使用二氧化硒脫氫而引入藥物中。按中國(guó)藥典中“硒檢查”法進(jìn)行檢查。（參見(jiàn)P62）基本方法

中國(guó)藥典采用氣相色譜法檢查殘留有機(jī)溶劑，其測(cè)定方法有溶液直接進(jìn)樣法和頂空進(jìn)樣法兩種。（參見(jiàn)P48）三、有機(jī)溶劑殘留量的檢查第52頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、游離磷酸鹽的檢查基本原理

使用標(biāo)準(zhǔn)品比較法，其標(biāo)準(zhǔn)品為磷酸二氫鉀溶液.在740nm處供試品的吸光度不得大于對(duì)照品.測(cè)定方法第53頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)含量測(cè)定甾體激素藥物測(cè)定的方法很多，藥典中常用的方法有比色法、紫外分光光度法和高效液相色譜法。

色譜條件

在甾體激素的定量分析中，常用的HPLC方法有兩種，即正相硅膠吸附色譜法和反相硅膠化學(xué)鍵合相分配色譜法。后者應(yīng)用最為廣泛，其色譜條件如下：

一、高效液相色譜法第54頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法（續(xù)）1、固定相：常為十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS，C18）。2、流動(dòng)相：多數(shù)為甲醇——水二元混合溶劑。個(gè)別藥物為了提高選擇性，采用三元混合溶劑，如、甲醇——水——乙腈，甲醇——水——乙醚等。測(cè)定方法：多數(shù)采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。常用240nm或280nm左右的紫外檢測(cè)。第55頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法（續(xù)）第56頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法（續(xù)）示例：黃體酮的含量測(cè)定1、內(nèi)標(biāo)物：已烯雌酚.2、測(cè)定方法:反相HPLC，含量按內(nèi)標(biāo)峰以峰面積計(jì)算.第57頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、紫外分光光度法

甾體激素分子中紫外光譜的發(fā)色團(tuán)1、

4-3-酮基：

它是甾體激素中最常見(jiàn)的發(fā)色團(tuán)，

max

約為240nm。2、芳香苯環(huán)：

A環(huán)為苯環(huán)的雌性激素在280nm附近有一個(gè)中等強(qiáng)度的吸收帶。方法的特點(diǎn)1、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，廣泛用于甾體激素原料藥的測(cè)定。2、選擇性和專屬性較差：原料和注射劑可以對(duì)其溶液直接測(cè)定，片劑采用“先分離，后測(cè)定”的原則。

第58頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、比色法

在甾體激素藥物的比色法中，常用四氮唑、異煙肼和Kober反應(yīng)等三種方法。(一)異煙肼比色法1、原理

甾體激素C3—酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合形成黃色異煙腙，在一定波長(zhǎng)下具有最大吸收。某些具有兩個(gè)酮基的甾體激素可形成雙腙。第59頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）2、測(cè)定方法

本法主要用于甾體激素制劑的測(cè)定，其基本步驟為：（1）、配制對(duì)照品溶液（2）、制備供試品溶液（3）、呈色反應(yīng)（4）、測(cè)定與比色第60頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）3、討論(1)、溶劑的選擇：只有用無(wú)水乙醇和無(wú)水甲醇才能得到滿意的結(jié)果，一般多選用乙醇。

其它溶劑因受到異煙肼鹽酸鹽在其中溶解度的限制不能采用。試劑在無(wú)水甲醇中的穩(wěn)定性較好，呈色強(qiáng)度也較在乙醇中為高，但由于它對(duì)植物油的溶解度較乙醇小，故一般多選用乙醇。

(2)、酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：當(dāng)酸與異煙肼試劑的摩爾比為2：1時(shí)，可獲得最大吸收度。而不同的酸所需要的濃度是不一樣的。第61頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）(3)、水分、溫度、光線和氧的影響：當(dāng)溶劑中含水量增高時(shí)，吸收度隨之降低。因?yàn)殓摅w激素與異煙肼的縮合為可逆反應(yīng)，水分可促使反應(yīng)逆轉(zhuǎn)而水解。溫度升高，反應(yīng)加速。當(dāng)在具塞玻管中不致使溶劑揮發(fā)及吸收水分的情況下，光與氧不影響反應(yīng)。

(4)、反應(yīng)的專屬性：本法對(duì)

4—3—酮甾體具有一定的專屬性。

第62頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）

具有

4—3—酮基的甾體激素，在室溫不到lh即可定量地與酸性異煙肼反應(yīng)；其他甾酮化合物需在長(zhǎng)時(shí)間放置或加熱后方可反應(yīng)完全，例如C20—酮化合物(黃體酮，可的松等)反應(yīng)就很慢。C17—酮化合物也可發(fā)生反應(yīng)并形成腙，Cll—酮在上述條件下不發(fā)生反應(yīng)。具有共扼雙鍵的另一些甾酮化合物，如

5—7—酮醋酸膽甾醇，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)反應(yīng)仍不能完全。因此，在上述反應(yīng)條件下，本法對(duì)

4—3—酮甾體具有一定的專屬性。

第63頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）(1)、氯化三苯四氮唑（TTC）氯化三苯四氮唑即為2,3,5—三苯基氯化四氮唑（2,3,5—triphenyltetrazoliumchloride,i.e.TTC），為無(wú)色試劑，其結(jié)構(gòu)為：

(二)四氮唑比色法1、四氮唑鹽的種類第64頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）(2)、藍(lán)四氮唑（Bluetetrazoline,i.e.BT）

BT的化學(xué)名為3,3’—二甲氧苯基—雙—4,4’—（3,5—二苯基）氯化四氮唑。該試劑為無(wú)色,其結(jié)構(gòu)為：第65頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）

四氮唑比色法是測(cè)量皮質(zhì)激素的重要方法?；贑17-

-醇酮基（-CO-CH2OH）的還原性，在強(qiáng)堿性溶液中被TTC或BT氧化，而TTC或BT被還原為有色的甲（formazan）衍生物，其顏色隨條件不同而產(chǎn)生差異，多為紅色或藍(lán)色。

2、反應(yīng)原理

第66頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）第67頁(yè),共73頁(yè)，2024年2月25日，星期天比色法（續(xù)）

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