蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)

關(guān)于蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯基因蛋白質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)生理狀態(tài)蛋白質(zhì)相互作用溫度應(yīng)激狀態(tài)培養(yǎng)條件藥物作用數(shù)量有限結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定復(fù)雜性多變性直接反應(yīng)生命現(xiàn)象復(fù)雜的調(diào)控第2頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義

蛋白質(zhì)組

protein+genomeproteome

一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)第3頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)組學(xué)旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達(dá)水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律

一、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義第4頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點(diǎn)的分離與分析

第5頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進(jìn)行：

1、根據(jù)溶解度

2、根據(jù)分子量透析和超濾平衡離心凝膠過(guò)濾層析

（三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法一、分離純化第6頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、根據(jù)電荷毛細(xì)管電泳離子交換層析一、分離純化第9頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力親和層析第10頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）蛋白質(zhì)分離純化的條件緩沖液鹽、金屬離子和螯合劑還原劑去垢劑蛋白酶抑制劑表面效應(yīng)蛋白質(zhì)的環(huán)境因素溫度儲(chǔ)存

一、分離純化第11頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、分析鑒定（一）Western印跡技術(shù)基本操作步驟：蛋白樣品的制備

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng)目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯示western印跡基本步驟圖示第12頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天Western免疫印跡用于測(cè)定特定蛋白質(zhì)的大小和含量

基本原理將經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體上，以針對(duì)特定蛋白質(zhì)的抗體作為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位進(jìn)行特異性反應(yīng)，結(jié)合上的抗體可用二抗檢測(cè)。常用的二抗是與辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白或A蛋白；實(shí)際應(yīng)用中常常還需要設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照。第13頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天常需要內(nèi)參蛋白量化蛋白量；GAPDH、ACTIN、ALBUMIN……第14頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

將SDS的高分辨能力與抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性相結(jié)合(靈敏度達(dá)到ng級(jí))

蛋白電泳在變性條件下進(jìn)行，消除了蛋白溶解、聚集以及與外來(lái)蛋白共沉淀等問(wèn)題

特點(diǎn)第15頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫熒光法(immunofluorescence)主要用于檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。

基本原理將待檢的目的蛋白作為抗原，固定在載玻片上，先加上針對(duì)目的蛋白的抗體(第一抗體)進(jìn)行反應(yīng)，再加上針對(duì)第一抗體的熒光素標(biāo)記抗體(第二抗體)進(jìn)行反應(yīng)，稱作間接免疫熒光法。如果將熒光素標(biāo)記在第一抗體上，則不用再加第二抗體，稱作直接免疫熒光法。

特點(diǎn)

需要在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；

無(wú)法檢測(cè)目的蛋白的大小；操作簡(jiǎn)便，但需設(shè)立必要的對(duì)照；第16頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫熒光法(immunofluorescence)例1例2第17頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫沉淀(immunoprecipitation)技術(shù)

將抗體加入蛋白混合溶液，使之與相應(yīng)抗原結(jié)合；

加入固定的抗體結(jié)合蛋白(如:ProteinA-瓊脂糖珠)；

經(jīng)離心后，與ProteinA結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物便可沉淀；

將樣品變性后即可獲得游離的抗原蛋白；

基本步驟

基本原理利用一種可離心沉淀的抗體結(jié)合蛋白(如ProteinA,ProteinG等)，將抗原-抗體復(fù)合物從蛋白混合溶液中分離，進(jìn)行定量或定性研究。為方便后續(xù)分析，在免疫沉淀前，常會(huì)對(duì)抗原進(jìn)行標(biāo)記。第18頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀(co-IP)技術(shù)

基于與蛋白質(zhì)X的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，則蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下來(lái)。Y的這種免疫沉淀被稱為免疫共沉淀(co-immunocipitation,Co-IP)，此法最常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合。YABY裂解細(xì)胞免疫共沉淀蛋白質(zhì)X第19頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）二維凝膠電泳（2-DE)

是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一由兩相組成：第一相：等電聚焦凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異二、分析鑒定第20頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天二維雙向電泳(2Delectrophoresis)

基本原理基于等電點(diǎn)與分子量分離蛋白質(zhì)IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel第21頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2-DE原理示意圖二、分析鑒定第22頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2-DE分析的基本步驟蛋白質(zhì)溶解變性還原去除蛋白質(zhì)雜志利用不同pK固定化電解質(zhì)可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業(yè)化軟件設(shè)計(jì)

第一相電泳：IPG－IFE平衡第二相電泳：SDS－PAGE考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色二、分析鑒定第23頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜

二、分析鑒定第24頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：可以同時(shí)直觀顯示數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；缺點(diǎn)：耗時(shí)，耗力，目前無(wú)法自動(dòng)化；難以分離疏水、具極端分子量或等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)（如膜受體蛋白、組蛋白等）。二維雙向電泳(2Delectrophoresis)silverstaining(~3000spots)第25頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)染色考馬斯亮藍(lán)染色銀染：靈敏度高；“雪崩”效應(yīng)；末端封閉銅染第26頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

通過(guò)2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過(guò)攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強(qiáng)弱和一定邊界方向的斑點(diǎn)電腦信號(hào)。

(三)圖像分析技術(shù)二、分析鑒定第27頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天2-DE圖像分析軟件包操作過(guò)程：

圖像采集斑點(diǎn)檢測(cè)背景消減獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息圖像內(nèi)及圖像間的比較二、分析鑒定第28頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

放射性核素標(biāo)記親和標(biāo)簽法正常細(xì)胞D0親和標(biāo)簽病理細(xì)胞D8親和標(biāo)簽混合并消化生物素親和純化液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析測(cè)量?jī)蓚€(gè)不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度二、分析鑒定第29頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白芯片(proteinchip)技術(shù)

將一系列“誘餌”蛋白以陣列方式固定在經(jīng)過(guò)特殊處理的底板上，然后將其與待分析的樣品雜交，只有那些和“誘餌”結(jié)合的蛋白才被保留在芯片上。其實(shí)質(zhì)是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定?；诘鞍踪|(zhì)表面化學(xué)及質(zhì)譜檢測(cè)的高通量蛋白質(zhì)分析技術(shù)第30頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白芯片(proteinchip)技術(shù)

基本方法

蛋白質(zhì)的結(jié)合：未經(jīng)處理的樣品(如血清，尿液等)直接點(diǎn)在芯片上，根據(jù)芯片表面不同的化學(xué)或生物特性結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)；

清洗減少非特異性蛋白(如鹽及其它污染物)的結(jié)合；

加能量吸收分子(EAM)：EAM能有效的吸收激光的能量，使樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離；

用表面增強(qiáng)的激光解吸電離法(SELDI)將保留在芯片上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)；

電離的蛋白質(zhì)可以通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀精確地測(cè)定它們的質(zhì)量；第31頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白芯片(proteinchip)技術(shù)從未經(jīng)提純的生物或臨床樣品中直接捕獲、檢測(cè)和分析蛋白質(zhì)不需任何標(biāo)記或加尾

超高的檢測(cè)靈敏度(1-50fmole的蛋白質(zhì))

從超小樣品體積(0.5μl)到大體積(400μl)

快速獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果第32頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白芯片(proteinchip)技術(shù)

ProteinChip的應(yīng)用第33頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)芯片第34頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量和電荷比值（質(zhì)荷比，m/e）的差異確定分子量。應(yīng)用蛋白質(zhì)的序列分析研究蛋白質(zhì)的修飾（五）質(zhì)譜技術(shù)二、分析鑒定

第35頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）其它方法Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)多肽的排列順序。核磁共振（NMR）、熒光光譜法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。X射線衍射分析法、小角中子衍射法測(cè)定晶體蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等。二、分析鑒定第36頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用

第37頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用二、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用

一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(ProteinDatabase)第38頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（三）蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（四）DIP數(shù)據(jù)庫(kù)第39頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)

SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)：

http://www.ebi.ac.uk/swissprotPIR和PSD數(shù)據(jù)庫(kù)

//pir第40頁(yè),共49頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)倉(cāng)庫(kù)

/pdb/