熒光原位雜交技術(shù)

關(guān)于熒光原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)簡介

insituhybridization原位雜交技術(shù)的基本原理是根據(jù)核酸分子堿基互補配對的原則，將有放射性或非放射性標記的外源核酸（探針）與經(jīng)過變性后的單鏈DNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，再經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在染色體、細胞或組織上的位置顯示出來的一項技術(shù)。該技術(shù)最早是PardueandGall(1969)和Johnetal.(1969)分別獨立建立起來的。當時使用的放射性標記探針，利用放射自顯影檢測一些高度重復(fù)序列DNA在染色體上的定位，此后原位雜交技術(shù)日益成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種十分重要的技術(shù)手段。盡管放射性標記探針靈敏度很高，能夠檢測小至幾百個堿基對的DNA序列，但是由于同位素的安全問題、半衰期、信號統(tǒng)計等限制了此項技術(shù)的廣泛應(yīng)用，后來逐漸發(fā)展出了非放射性標記探針原位雜交技術(shù)。第2頁,共38頁，2024年2月25日，星期天原位雜交操作步驟一、準備載玻片和固定材料二、染色體標本制備和預(yù)處理三、探針制備及標記四、染色體標本變性五、雜交六、雜交后洗脫七、免疫細胞化學(xué)檢測八、熒光顯微鏡觀察及顯微攝影第3頁,共38頁，2024年2月25日，星期天染色體標本制備第4頁,共38頁，2024年2月25日，星期天預(yù)處理1、RNA酶處理

1）每張玻片加100μl100μg/mlRNaseA(in2xSSC)37℃處理1小時2）用2xSSC洗3×5min3）70%，80%，100%乙醇系列脫水，每級5分鐘2、胃蛋白酶處理

1）0.005-0.02%pepsin（10mMHCl）37℃處理10min2）1×PBS洗2×5min3）1×PBS，50mMMgCl2處理5min4）1×PBS，50mMMgCl2,1%甲醛固定10min5）PBS洗滌并脫水,氣干第5頁,共38頁，2024年2月25日，星期天非放射性標記法直接法熒光素（fluorescein）或其他熒光染料間接法地高辛（digoxigenin）生物素（biotin）1.隨機引物法2.缺口平移法3.PCR法4.寡核苷酸末端標記法5.直接在探針3’或5’端合成第6頁,共38頁，2024年2月25日，星期天1.0.5ml離心管中加入1ug探針DNA,加水置體系為16ul2.沸水浴中變性10min,馬上置于冰水中3.加入4ulDIG-High

Prime(5xbuffer;50%glycerol;1U/μlKlenowenzyme;5xrandomprimermix;1mMeachofdATP,dCTP,anddGTP;0.65mMdTTP;and0.35mMDIG-11-dUTP)4.混勻離心，置于37℃溫育1小時~20小時5.65℃處理10min終止反應(yīng)第7頁,共38頁，2024年2月25日，星期天染色體標本變性共變性雜交液加到標本上封片，置80℃烘箱中10分鐘分別變性70%甲酰胺，2xSSC70℃處理2分鐘70%，85%，100%冷乙醇系列脫水，空氣干燥第8頁,共38頁，2024年2月25日，星期天1.雜交液(50%去離子甲酰胺,2xSSC,10%硫酸葡聚糖,50mM磷酸鈉;pH7)中加入標記的探針，每10ul雜交液含50ng探針2.探針95℃變性5分鐘，置冰水中10分鐘3.10ul雜交液加到標本上，蓋蓋玻片并封片4.濕盒中37℃雜交過夜雜交第9頁,共38頁，2024年2月25日，星期天1.2xSSC,50%甲酰胺45℃洗3x5min2.2xSSC37℃洗2x5min3.TNTbuffer[100mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.05%Tween20]37℃洗1x5min雜交后洗脫第10頁,共38頁，2024年2月25日，星期天1.TNTbuffer沖洗2.TNBbuffer[100mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.5%blockingreagent]3.Anti-DIG-熒光素(2μg/ml,inTNB)37℃30min4.TNTbuffer沖洗3x5min5.乙醇系列脫水,氣干6.DAPI染色10min7.加Vectashield封片,熒光顯微鏡下觀察并照相免疫細胞化學(xué)檢測第11頁,共38頁，2024年2月25日，星期天影響雜交的因素一、影響雜交的主要因素溫度、pH、單價陽離子濃度、甲酰胺二、其他因素探針長度、探針濃度、硫酸葡聚糖、洗脫嚴謹度三、標準雜交條件第12頁,共38頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共38頁，2024年2月25日，星期天FISH技術(shù)的應(yīng)用基因定位染色體結(jié)構(gòu)變異(異位、缺失、重復(fù))研究染色體物理作圖疾病及產(chǎn)前診斷外源基因檢測多倍體起源進化研究分子核型研究染色體（質(zhì)）空間結(jié)構(gòu)研究第14頁,共38頁，2024年2月25日，星期天熒光原位雜交技術(shù)新進展M-FISH，armFISH(42-colorM-FISH),SKYBAC-FISH,YAC-FISHFiber-FISHPRINS(PrimedinsituDNAsynthesis)引物原位DNA合成技術(shù)IS-PCR(in

situpolymerasechainreaction)原位PCRGISH(GenomeinsituHybridization)基因組原位雜交Immuno-FISH3D-FISHQ-FISH（Quantitative-FISH），F(xiàn)low-FISHT-FISH（Tissue-FISH）or(Telomere-FISH)RNA-FISH第15頁,共38頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLab5種熒光素聯(lián)合標記人類24條染色體

熒光素12345678910111213141516171819202122XY

FITC☆☆☆☆☆☆☆☆☆☆☆

Cy3△△△△△△△△△△

Cy3.5○○○○○○○○○○○

Cy5※※※※※※※※※※

Cy7◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆

第17頁,共38頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共38頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

光譜核型分析（spectralkaryotyping,SKY)SKY是另一種M-FISH,實驗操作和結(jié)果與M-FISH相似。原始圖像利用干涉儀產(chǎn)生干涉信號，再采用高性能CCD數(shù)碼相機進行拍攝，得到一組不同光程差的干涉圖像。再將所得數(shù)據(jù)做FFT(快速傅立葉變換),得到每一點的光譜信息。通過分析光譜信息，發(fā)現(xiàn)原始圖像的信息。第20頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLab干涉儀鏡子收集光線標本發(fā)射光譜CCD相機傅立葉轉(zhuǎn)換分析光譜信息通過光譜分析準確分析A圖中的色彩分為相近的三種染色體（C圖）第21頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLab該技術(shù)操作簡單，只需進行一次雜交，一次拍攝，而傳統(tǒng)M-FISH在拍攝過程中要變換多次濾光片。該技術(shù)靈敏度高，由于摒棄了傳統(tǒng)M-FISH采用的以濾光片為基礎(chǔ)的成像技術(shù)，在拍攝過程中全光譜通過，因此光通過量大大提高，從而提高靈敏度。分析準確率高，整個分析基于光譜信息，所以準確率極高，即使是染色體末端的微弱信號，也同樣可以采集到。第22頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLab利用SKY技術(shù)，準確判斷出7號染色體和12號染色體之間的交叉易位。第23頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLabG帶分析得到一條marker染色體無法確認起源，用SKY確定來源于18號。第24頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLabFiber-FISH

DNA纖維的制備是先將單細胞懸浮液涂在載玻片上，然后利用堿變性劑或EDTA-SDS緩沖液等化學(xué)方法將染色體的結(jié)構(gòu)破壞，讓DNA分子與復(fù)合的蛋白質(zhì)分離而形成游離的DNA纖維，再以這種失去空間結(jié)構(gòu)的線性DNA分子作為靶DNA的載體進行原位雜交，使分辨率和靈敏度都有了很大的提高。第25頁,共38頁，2024年2月25日，星期天

ChromosomeLab在不同靶DNA上熒光原位雜交技術(shù)的比較靶DNA結(jié)構(gòu)分辨率水平可檢測DNA優(yōu)點和缺點序列范圍中期染色體1——3Mb>1Mb保持染色體結(jié)構(gòu)，切片容易制備分辨水平低，識別染色體困難前期染色體200Kb>200Kb保持染色體結(jié)構(gòu),分辨水平居中切片不易制備,識別染色體困難拉長的中期染色體200Kb>200Kb保持染色體著絲點端粒結(jié)構(gòu)，分辨率水平居中，拉長染色體不均勻粗線期染色體100Kb>100Kb保持染色體結(jié)構(gòu)，識別染色體可能，分辨率水平較高，切片不易制備間期細胞核50Kb50Kb-2mb分辨率水平高，切片容易制備，無染色體結(jié)構(gòu)，游離染色質(zhì)絲10Kb10Kb-1mb分辨率水平高，無染色體結(jié)構(gòu)DNA纖絲1Kb1Kb-1mb分辨水平高，無染色體結(jié)構(gòu)第26頁,共38頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共38頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共38頁，2024年2月25日，星期天基因組原位雜交（GISH）第29頁,共38頁，2024年2月25日，星期天RNA-FISH第30頁,共38頁，2024年2月25日，星期天T-FISH第31頁,共38頁，2024年2月25日，星期天蠶豆紅小豆黃豆豇豆綠豆第32頁,共38頁，2024年2月25日，星期天小麥水稻玉米第33頁,共38頁，2024年2月25日，星期天金不換第34頁,