水中嗜肺軍團菌檢驗方法 酶底物定量法

2水中嗜肺軍團菌檢驗方法酶底物定量法本文件描述了水中嗜肺軍團菌酶底物定量檢驗法。本文件適用于冷卻水、冷凝水和沐浴用水中嗜肺軍團菌的檢驗，其他水質(zhì)檢驗可參考本文件進行。本方法定量限為1MPN/100mL。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18204.5公共場所衛(wèi)生檢驗方法第5部分：集中空調(diào)通風系統(tǒng)GB/T18204.6公共場所衛(wèi)生檢驗方法第6部分：衛(wèi)生監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1嗜肺軍團菌LegionellaPneumophila軍團菌目、軍團菌科、軍團菌屬中的一種桿菌。注：菌體大小為（0.3～0.4）μm×（2～3）μm。無莢膜，無芽孢，有端生鞭毛，革蘭染色陰性，常呈梭形3.2最可能數(shù)mostprobablenumber；MPN稀釋培養(yǎng)計數(shù)一種基于泊松分布的間接計數(shù)方法。注：利用統(tǒng)計學原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的4方法原理該方法基于一種細菌酶檢驗技術(shù)，嗜肺軍團菌利用培養(yǎng)基中豐富的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)物質(zhì)迅速地生長，經(jīng)分解代謝作用與培養(yǎng)基中的酶底物發(fā)生反應(yīng)使溶液渾濁或顯褐色。5培養(yǎng)基與試劑5.1酶底物法培養(yǎng)基5.1.1成分N-氨基甲酰甲基乙磺酸緩沖液（ACES）10.0g酵母膏3.5g硫酸鎂0.35g丙酮酸鈉0.45g3氨基酸硫代硫酸鈉二氯化錳抗生素4.70.007 0.030.35gggg5.1.2制法將以上成分按比例溶解在1000mL無菌水中，121℃高壓滅菌15min。5.2預(yù)處理液的配制稱取2.04g雷伯環(huán)衍生物有機酸加入100mL無菌水中混勻。5.3硫代硫酸鈉溶液的配制稱取26g硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）溶液（或16g無水硫代硫酸鈉），溶于1L水中，并加熱煮沸10min，冷卻，過濾后避光備用。5.4BCYE培養(yǎng)基5.4.1成分N-2-乙酰氨基-2-酰氨基乙烷磺酸（ACES）緩沖液10.0g氫氧化鉀2.8g活性炭2.0g酵母提取物（細菌級）10.0gα-酮戊二酸鉀鹽1.0g瓊脂12.0gL-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物0.4g焦磷酸鐵（III）0.25g水1000mL5.4.2制法5.4.2.1將0.4gL-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物加到10mL水中。通過孔徑為0.22μm的膜過濾器過濾，對溶液進行過濾滅菌。5.4.2.2將0.25g焦磷酸鐵（III）加到10mL水中。通過孔徑為0.22μm的膜過濾器過濾，對溶液進行過濾滅菌。5.4.2.3將10gN-2-乙酰氨基-2-酰氨基乙烷磺酸（ACES）緩沖液添加到含500mL水的容器中，于45℃~50℃的水浴中溶解。用0.1mol/L氫氧化鉀溶液和0.1mol/L硫酸溶液，將ACES緩沖溶液的pH調(diào)至6.8±0.1。5.4.2.4將2.8g氫氧化鉀添加到480mL水中，并輕輕搖動使其溶解。5.4.2.5混合5.4.2.3、5.4.2.4中的兩種溶液，并依次添加2g活性炭、10g酵母提取物和1gα-酮戊二酸鉀鹽，每次添加之間要充分混合。加入瓊脂，充分混合并在121℃高壓滅菌15min后，在水浴中冷卻至（50±2）℃。5.4.2.6無菌添加L-半胱氨酸（5.4.2.1）和焦磷酸鐵（III）溶液（5.4.2.2），每次添加之前應(yīng)充分混合。在25℃下培養(yǎng)基的pH應(yīng)為6.8±0.2。5.5BCYE-cys培養(yǎng)基該培養(yǎng)基應(yīng)按照5.4進行制備，但不添加L-半胱氨酸鹽酸鹽-水合物。5.6無菌水使用符合三級水要求的實驗用水，經(jīng)121℃高壓滅菌15min備用。5.7標準菌株陽性對照標準菌株：嗜肺軍團菌（CICC24883/ATCC33152或其它同類菌株）；4陰性對照標準菌株：糞腸球菌（CICC10396/ATCC29212或其它同類菌株）。6儀器設(shè)備6.1高壓蒸汽滅菌器：121℃（0.10MPa～0.12MPa）。6.2干熱滅菌器（烤箱）：60℃~80℃、160℃~180℃。6.3生化培養(yǎng)箱或恒溫恒濕培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.4CO2培養(yǎng)箱：CO2濃度為2.5%、36℃±1℃。6.5三角瓶：帶蓋的無菌玻璃瓶或者聚乙烯瓶。6.6采樣瓶（含硫代硫酸鈉）：含0.1mol/L硫代硫酸鈉（Na2S2O3）的無菌廣口玻璃瓶或者聚乙烯瓶。6.7程控定量封口機。6.8定量盤：定量培養(yǎng)用無菌塑料盤，含96個孔穴，其中6個大孔（13.7mL/大孔90個小孔（0.2mL/小孔）。6.9定量盤橡膠襯墊：與96孔定量盤配套使用。6.10吸管：1mL、10mL無菌玻璃吸管或可調(diào)式移液管。6.11試管：5mL或10mL無菌帶蓋玻璃試管或者離心管。6.12量筒：100mL±1mL。6.13生物安全柜。7樣品的采集7.1采樣瓶的準備與滅菌采樣瓶準備時應(yīng)添加硫代硫酸鈉溶液（5.3）消除活性氯對嗜肺軍團菌的干擾。將濃度為0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液與擬采集水樣體積按照1∶1000的比例加入采樣廣口玻璃瓶中，于160℃~180℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器，121℃高壓滅菌15min。干熱滅菌的采樣瓶應(yīng)在兩周內(nèi)使用；濕熱滅菌的采樣瓶如不能立即使用，應(yīng)于60℃烤箱內(nèi)將瓶內(nèi)冷凝水烘干，兩周內(nèi)使用。7.2樣品采集按照GB/T18204.5的要求采集冷卻水和冷凝水，冷卻水樣品采集應(yīng)在距冷卻塔壁20cm、液面下10cm處，冷凝水樣品采集應(yīng)在排水管或冷凝水盤處；按照GB/T18204.6的要求采集沐浴用水，沐浴用水樣品采集應(yīng)隨機選擇5個沐浴噴頭；在沐浴池選擇3個采樣點，采集水面下30cm處水樣。每個采樣點依無菌操作取樣500mL。7.3樣品運輸與保存樣品應(yīng)在常溫條件下避光保存，并在48h內(nèi)送往實驗室開展檢驗。8檢驗步驟8.1稀釋根據(jù)對樣品污染狀況的估計，將樣品稀釋至可計數(shù)濃度范圍。稀釋方法：以無菌操作方法吸取10mL充分混勻的水樣，加入到含有90mL無菌水的三角瓶中，混勻成1∶10的稀釋液，按照同法遞增稀釋，每稀釋一個濃度梯度，更換一支10mL吸管。8.2接種8.2.1取100mL配制好的酶底物法培養(yǎng)基到無菌三角瓶中備用。8.2.2取2mL預(yù)處理液到無菌試管中。8.2.3將2mL水樣原液和/或稀釋液分別加到含有2mL預(yù)處理液的試管中，混勻,于常溫下靜置（60±5）s，靜置結(jié)束前再次混勻試管內(nèi)液體，并立即取2mL加到100mL酶底物法培養(yǎng)基（8.2.1）中混勻。8.2.4將8.2.3三角瓶中的液體全部加到96孔定量盤中，以手撫平96孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡后用程控定量封口機封口。觀察96孔定量盤顏色，若出現(xiàn)與陽性對照顏色相同，應(yīng)終止試驗或重新操作。58.3培養(yǎng)將96孔定量盤紙面向下放置于36℃±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，且培養(yǎng)箱中水盤避免干涸。8.4對照試驗8.4.1空白對照制備1個100mL無菌水樣品，按照8.2和8.3的步驟進行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤應(yīng)無任何顏色或濁度變化。8.4.2陰性對照制備1個（103～104）CFU/mL的100mL糞腸球菌菌懸液，按照8.2和8.3的步驟進行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤應(yīng)無任何顏色或濁度變化。8.4.3陽性對照制備1個（102～103）CFU/mL的100mL嗜肺軍團菌菌懸液，按照8.2和8.3的步驟進行操作。培養(yǎng)后的96孔定量盤應(yīng)顯褐色或濁度大于空白對照。9檢驗結(jié)果9.1未檢出將培養(yǎng)7d后的定量盤取出觀察。如所有孔穴內(nèi)水樣的顏色與濁度和空白對照無差異，可直接報告結(jié)果。結(jié)果報告為“未檢出/100mL”。9.2檢出如孔穴內(nèi)的水樣有顯褐色或者濁度大于空白對照的，則表示該孔穴中含有嗜肺軍團菌。記錄所有顯褐色或有濁度變化的孔穴數(shù)量，對照附錄A中表A.1，查出其代表的嗜肺軍團菌最可能數(shù)（MPN）。并按照公式（1）進行嗜肺軍團菌濃度計算，結(jié)果采用兩位有效數(shù)字的科學計數(shù)法表示，單位為MPN/100mL。c=MPN值×100×b 式中：c--嗜肺軍團菌濃度，單位為MPN/100mL；MPN值--96孔定量盤陽性孔數(shù)查表所得結(jié)果；b--接種樣品的稀釋倍數(shù)。9.3菌型確定如需對嗜肺軍團菌陽性結(jié)果進行菌型確定，可按照附錄B進行操作。10質(zhì)量控制10.1每批樣品應(yīng)進行空白對照試驗,并使用有證標準菌株進行陽性和陰性對照試驗（8.4）。10.2按照質(zhì)控要求，定期使用有證標準菌株/質(zhì)控樣品進行質(zhì)量控制。11生物安全嗜肺軍團菌檢驗應(yīng)按照三類病原微生物的生物安全要求進行管理。（規(guī)范性）96孔定量盤MPN表96孔定量盤MPN表見表A.1。表A.196孔定量盤MPN表0123456012345678901234568（資料性）菌型確定菌型確定按如下步驟進行：a)用75%酒精擦拭定量盤背面顯褐色或