毒理學實驗基礎

關于毒理學實驗基礎引言以科學研究為目的而進行科學飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。實驗動物學作為在現代科學帶動崛起的一門以生命科學為主體，以醫(yī)學、生物為核心的綜合性獨立的新興學科，正以嶄新的面貌，異乎尋常的速度，影響著整個生命科學各領域，成為生命科學研究的奠基學科和重要支撐條件，因而受到世界各國政府和科學家的重視，甚至作為衡量一個國家生物科學水平高低的標志之一。第2頁,共98頁，2024年2月25日，星期天食品毒理學的很多研究工作需要通過動物實驗來進行。使用實驗動物進行科研的優(yōu)點是花費人力、物力較少，時間短，易發(fā)現單因素與結果的關系，能提供大量有價值的可與人類生命活動現象相類比的資料。在毒理學實驗研究中，健康的實驗動物是保證工作順利進行和獲得正確可靠的研究結果的重要條件。第3頁,共98頁，2024年2月25日，星期天食品毒理學研究外源化學物對于機體(特別是人體)的有害作用及其機制。食品毒理學研究的主要手段是動物實驗。體內試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學物對實驗動物的毒性反應，向人(原型)外推，以期評估外源化學物對人的危害及危險性。體外實驗主要用于篩選和預測急性毒性和機制研究；人體實驗和流行病學調查則可進一步深化和證實在動物實驗中所得到的資料。實際上，食品毒理學作為一門實驗科學是以動物實驗為中心的，食品毒理學動物實驗的設計、實施、結果觀察和評價是毒理學研究的基本方法。第4頁,共98頁，2024年2月25日，星期天食品毒理學試驗是對化學物安全性評價的主要手段，已為各國際組織或各國的行政部門所頒布的規(guī)程或指南列為常規(guī)試驗，又稱為法規(guī)毒理學試驗(regulatorytoxico1ogytest)，這類毒理學試驗是以篩查和描述外來化學物的毒性為目的，屬于描述毒理學范疇。第5頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)食品毒理學實驗的原則和局限性一、食品毒理學實驗的原則在毒理學的試驗中，有三個基本的原則。第一個原則，化學物在實驗動物產生的作用，可以外推于人?；炯僭O為：①人是最敏感的動物物種；②人和實驗動物的生物學過程包括化學物的代謝，與體重(或體表面積)相關。這兩個假設也是全部實驗生物學和醫(yī)學的前提。第6頁,共98頁，2024年2月25日，星期天以單位體表面積計算在人產生毒作用的劑量和實驗動物通常相近似。而以體重計算則人通常比實驗動物敏感，差別可能達10倍。因此可以利用安全系數來計算人的相對安全劑量。已知人致癌物都對某種實驗動物具有致癌性；實驗動物致癌物是否都對人有致癌性，還不清楚，但這已作為動物致癌試驗的基礎。一般認為，如果某一化學物對幾個物種實驗動物的毒性是相同的，則人的反應也可能是相似的。第7頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第二個原則是實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現對人潛在危害的必需的和可靠的方法。此原則是根據質反應的概念，隨劑量或暴露增加，群體中效應發(fā)生率增加。毒理學試驗中，一般要設3個或3個以上劑量組，以觀察劑量-反應(效應)關系，確定受試化學物引起毒效應及其毒性參數。毒性試驗的設計并不是為了證明化學品的安全性，而是為了說明化學品可能產生的毒作用。第8頁,共98頁，2024年2月25日，星期天僅僅檢測受試化學物在人的暴露劑量是否引起毒效應是不夠的。當引起毒效應的最低劑量(LOAEL)與人的暴露劑量接近時，說明該化學物不安全。當該劑量與人的暴露劑量有很大的距離(幾十倍，幾百倍或以上)，才認為具有一定安全性，此距離越大，安全性越可靠。如果在研究中所用的一系列的劑量不能引起毒性效應，則認為所用劑量還不足夠高，應增加劑量，以確定受試化學品的毒性。但如果在試驗的最高劑量組的劑量與人可能的暴露劑量有足夠的安全界限，則對于安全性評價來說未觀察到毒效應的研究是可以接受的。第9頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在毒理學試驗中實驗模型所需的動物總是遠少于處于危險中的人群。為了在少量動物得到有統(tǒng)計學意義的可靠的結果，需要應用相對較高的劑量，以使效應發(fā)生的頻率足以檢測。例如，低達0.01％的癌癥發(fā)生率，這意味著在100萬人群中有100人發(fā)生癌癥，此發(fā)生率太高，不能為公眾接受。在實驗動物直接檢測如此低發(fā)生率將至少需要30000只動物。因此，別無選擇，在毒理學試驗中，對相對較少的實驗動物必須以較高劑量進行試驗，然后根據毒理學原則外推估計低劑量暴露的危險性。第10頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第三個原則，成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物是為了使實驗結果具有代表性和可重復性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物作為一般人群的代表性實驗模型，而將幼年和老年動物、妊娠的雌性動物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實驗對象的多樣性，減少實驗誤差。第11頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒理學實驗結果的敏感性取決于受試物處理引起毒效應強度和實驗誤差兩個因素，處理引起的毒效應強，實驗誤差小，則實驗結果的敏感性增加，反映受試物處理的真實效應，反之亦然。在下文所述的實驗設計是要規(guī)定實驗條件，嚴格控制可能影響毒效應的各種因素，實施質量保證，降低實驗誤差。只有這樣，才能保證試驗結果的準確性和可重復性，不能重復的實驗結果是沒有任何科學價值的。外源化學物以不同途徑染毒，實驗動物表現的毒性可能有很大差異，這是由于因染毒部位解剖生理特點不同，外源化學物吸收進入血液的速度和量也不同，首先到達的器官和組織也不同。因此，毒理學試驗中染毒途徑的選擇，應盡可能模擬人接觸該受試物的方式。

第12頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、食品毒理學實驗的局限性歷史上，環(huán)境污染物及某些藥物所引起的中毒和死亡多次發(fā)生，引起各國的重視，推動了毒理學的發(fā)展，各國政府主管部門制訂和多次修訂了有關藥品和各種化學品安全性評價的規(guī)范或準則，希望在嚙齒類和非嚙齒類的毒理學研究能為有關候選新藥和各種化學品提供安全性證據，但以動物的資料預測人的毒性的預測價值尚有待于研究。第13頁,共98頁，2024年2月25日，星期天Lumley(1990)和Igarashi(1994)根據有限的臨床資料報告，發(fā)現對人的毒性約一半不能由臨床前(動物)毒性研究預測。Heywood(1983)報告27個化學物(大多為藥品)的靶器官毒性在大鼠和狗(或猴)之間的相符率僅20％。Olson等(1998)報告131種化學物對動物的毒性與人的毒性相符率，嚙齒類為6％，非嚙齒類(狗和猴)為28％，合并達36％，所有的物種相符率可達69％。第14頁,共98頁，2024年2月25日，星期天按照目前的規(guī)范，進行毒理學安全性評價，可以在一定程度上提高新藥和各種化學品的使用安全性，但仍不能完全排除對人健康危害的風險。WHO在《臨床前藥物安全性實驗原則》的文件中指出“雖然事先對生物活性物質進行了最仔細徹底的研究，但給人使用時總是不可避免地要冒一定的風險?！边@就是利用動物實驗的局限性，即動物實驗的結果外推到人的不確定性。第15頁,共98頁，2024年2月25日，星期天用實驗動物的毒理學實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性。這是因為，外源化學物的毒性作用受到許多因素的影響。第16頁,共98頁，2024年2月25日，星期天首先，實驗動物和人對外源化學物的反應敏感性不同，有時甚至存在著質的差別。雖然在毒理學實驗中通過用兩種或兩種以上的動物，并盡可能選擇與人對毒物反應相似的動物，但要完全避免物種差異是不可能的。而且，實驗動物不能述說涉及主觀感覺的毒效應，如疼痛、腹脹、疲乏、頭暈、眼花、耳鳴等，這些毒效應就難以或不可能發(fā)現。在動物實驗中，可觀察到體征(sign)，而沒有癥狀(symptom)。第17頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第二，在毒理學實驗中，為了尋求毒作用的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應或劑量-效應關系，往往選用較大的染毒劑量，這一劑量通常要比人實際接觸的劑量大得多。有些化學物在高劑量和低劑量的毒性作用規(guī)律并不一定一致，如大劑量下出現的反應有可能是由于化學物在體內超過了機體的代謝能力，這就存在高劑量向低劑量外推的不確定性。第18頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第三，毒理學實驗所用動物數量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應，在少量動物中難以發(fā)現。而化學物一旦進入市場，接觸人群往往會很大。這就存在小數量實驗動物到大量人群外推的不確定性。第19頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第四，實驗動物一般都是實驗室培育的品系，一般選用成年健康動物，反應較單一，而接觸人群可以是不同的人種、種族，而且包括年老體弱及患病的個體，在對外源化學物毒性反應的易感性上存在很大差異。以上這些都構成了從毒理學動物實驗結果向人群安全性評價外推時的不確定因素。第20頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)毒理學毒性評價試驗的基本目的毒理學實驗的常規(guī)部分是毒性評價或安全性評價試驗。為了對受試物的毒性進行全面的測試，增強測試結果的可靠性，權威機構規(guī)定了評價程序，以保證毒性評價研究可以達到普遍能接受的最低要求和原則。毒理學家認為毒理學試驗程序應該有一定的靈活性。對毒理學試驗的原理和設計思路的深入理解，有助于研究者對評價程序的實施，在發(fā)現新的現象或線索時，可進行一些補充實驗來證實，并可進一步研究其機制。第21頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒性評價或安全性評價方面的基本目的包括以下幾點：

1.受試物毒作用的表現和性質在急性和慢性毒性試驗中，觀察受試物對機體的有害作用，對有害作用的觀察應該是對每個實驗動物進行全面的逐項的觀察和記錄。發(fā)現有害作用是進行劑量-反應(效應)研究的前提。第22頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2.劑量-反應(效應)研究劑量-反應(效應)研究是毒性評價和安全性評價的基礎。通過對不同有害作用的劑量-反應(效應)研究，可以得到該受試物的多種毒性參數。在急性(致死性)毒性試驗中，應該得到LD50，也可以得到LD01和MTD。在急性非致死性毒性試驗中，應該得到急性可觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)。在亞急性、亞慢性及慢性毒性試驗中，應該得到相應的LOAEL和NOAEL。在致突變、致癌和致畸等特殊毒性試驗中，劑量-反應(效應)研究將為確定受試物是否具有這些特殊毒性提供依據。在致畸試驗也可得到LOAEL和NOAEL；在致突變、致癌試驗中，盡管認為是無閾值的，但也可得到表觀的LOAEL和NOAEL。第23頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.確定毒作用的靶器官。確定受試物有害作用的靶器官，是毒理學研究的重要目的，以闡明受試物毒作用的特點，并為進一步的機制研究和毒性防治提供線索。4.確定損害的可逆性。一旦確認有害作用存在，就應研究停止接觸后該損害是否可逆和消失，器官和組織功能是否能恢復，還是像化學致癌作用那樣停止接觸后損害繼續(xù)發(fā)展?毒性的可逆性關系到對人的危害評價，如果受損的器官組織能夠修復并恢復正常功能，則可能接受較高危險性的接觸水平。第24頁,共98頁，2024年2月25日，星期天當然，毒理學研究還可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測指標和生物學標志、毒作用機制研究、受試物的毒物動力學和代謝研究、中毒的解救措施等。對這些要求，應擴展常規(guī)試驗的設計以包括有關的項目，或者另外設計和進行靶器官毒理學研究及機制毒理學研究。第25頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)實驗動物的選擇和處理毒理學的動物實驗是以實驗動物作為研究對象的，為獲得可靠的研究結果，先決條件是正確地選用實驗動物。第26頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一、實驗動物物種的選擇外源化學物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物之間表現不同，物種差別可以表現在量方面，引起毒性的劑量差別，即毒性大小的差別，如有報道，對人138種化學物的敏感性為大鼠的1.8～10.5倍。物種差別也可以表現在質方面(毒性效應的差別)，如除草劑百草枯(對草快)對人引起肺損傷，而對狗則未見到。因此，需要對實驗動物物種進行選擇。物種間毒性反應差別的原因，可能歸納為解剖與生理學差異，遺傳與代謝的差異等。第27頁,共98頁，2024年2月25日，星期天對實驗動物物種選擇的基本原則是：選擇對受試物在代謝、生物化學和毒理學特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；經濟并易于獲得的物種。在選擇實驗動物時存在固有的限制?？衫玫奈锓N不多，主要原因包括經濟(購買和飼養(yǎng)的費用)、實驗動物的壽命、行為和生活能力、處置，以及對所研究的毒性的敏感性。要利用對受試物在代謝、生物化學和毒理學特征與人最接近的物種，這就需要了解實驗動物物種和人對受試化學物的吸收、生物轉化等資料，但這往往并不切合實際，因為首先需要進行一系列的比較研究，而對人體的資料在動物試驗之前是很難得到的。第28頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在毒理學研究中常用的實驗動物物種如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。其中，大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠為嚙齒目動物。常用實驗動物生物學和生理學參數見表5-1。第29頁,共98頁，2024年2月25日，星期天參數猴狗貓兔大鼠小鼠豚鼠地鼠成體體重(kg)3.514.03.33.70.450.0350.430.12壽命(a)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530飼料消耗(成本g/d)1504001001801051210成體代謝(cal／kgd)1588080110130600100250體溫(℃)38.838.938.639l438l237.438.638.0呼吸頻率50202553851609083(次／min)(40～60)(10～30)(20～30)(40～65)(65～110)(80～240)(70～100)(35～130)心率(次／min)200100120200328600300450血壓mmHg159／127148／100155／100110／80130/90120／7577/50108/77(收縮／舒張)出生體重(g)500～7001100～22001251005-61.575～1002.0表5-1常用實驗動物生物學和生理學參數第30頁,共98頁，2024年2月25日，星期天斷乳時體重(g)440058003000100～150040～5010～1225035開眼(d)出生當天8～128～121010～1211出生當天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215～2815～164～54～516～194動情期(d)1～27～139～19301111窩數量13～61～61～136～91～121～51～12斷乳年齡(周)16～2466～983～4323～4生殖年齡(月)549106～72～3232生殖期(年)10～155～1041～31131生殖季節(jié)任何時間春，秋冬季2～3個月任何時間任何時間任何時間任何時間任何時間所需面積(ft2)*68330.40.40.70.34環(huán)境溫度(℃)18～2818～2818～2818～2819～2519～2519～2519～25血容量(ML/Kg)7579605365807585凝血時間(s)90180120300601460143HCT(％紅細胞)4245404246414250Hb(g／bl)12.516.011.813.614.816.012.412.0*所需面積(ft2)，即為英尺，1ft＝30.48cm．第31頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、實驗動物品系的選擇品系(strain)是實驗動物學的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。實驗動物按遺傳學控制分類可分為：第32頁,共98頁，2024年2月25日，星期天①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白I、津白Ⅱ、615，DBA／1和DBA／2，BALB/C，C3H，C57B／6J，A和A／He等。②雜交群動物(雜交1代，F1)，指兩個不同的近交系之間有目的進行交配，所產生的第一代動物。③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。第33頁,共98頁，2024年2月25日，星期天如昆明種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。

根據實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動物對外源化學物毒性反應有差別，所以毒理學研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學物毒理學系列研究中應固定使用同一品系動物，以求研究結果的穩(wěn)定性。第34頁,共98頁，2024年2月25日，星期天遺傳毒理學一般利用嚙齒類動物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。有的文獻報告在小鼠骨髓微核試驗MS／Ae品系比ddy，CD-1或BDF品系更敏感。但一般認為還沒能證明某一品系對所有的遺傳毒性物質比其他品系都敏感。在致癌試驗中對實驗動物的品系有一定的要求，特別重視有關病理損害的自發(fā)發(fā)生率。例如，某些大鼠品系垂體腫瘤發(fā)生率高，則不適用于靶器官為內分泌系統(tǒng)的毒性研究。又如B6C3F1雄小鼠肝腫瘤高發(fā)生率可能有礙于肝致癌反應的檢測。第35頁,共98頁，2024年2月25日，星期天三、對實驗動物微生物控制的選擇按微生物控制分類，實驗動物分為四級，見表5-2。對于毒性試驗及毒理學研究應盡可能使用二級(或二級以上)的動物，以保證實驗結果的可靠性。第36頁,共98頁，2024年2月25日，星期天表5-2實驗動物微生物等級第37頁,共98頁，2024年2月25日，星期天四、個體選擇實驗動物對外來化學物的毒性反應還存在個體差異，應注意實驗動物的個體選擇。

1.性別同一物種、同一品系的實驗動物雌雄兩性通常對相同外源化學物毒性反應類似但雌雄兩性對化學物的毒性敏感性上存在著差別。有文獻報道在149種外源化學物中雌雄敏感性比值小鼠平均為0.92，大鼠為0.88，這種差別表現在實驗動物性發(fā)育成熟開始，直至老年期。可見雌雄兩性動物的性激素性質和水平是關鍵因素。第38頁,共98頁，2024年2月25日，星期天如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則應選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現存在性別差異，則應將不同性別動物的實驗結果分別統(tǒng)計分析。第39頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在遺傳毒理學體內試驗中，對性別的選擇有幾種意見：

(1)對單個物種應用兩種性別。

(2)對單個物種應用兩種性別，除非已在一個性別得到陽性反應，就不必對另一種性別進行試驗。

(3)對單個物種應用兩種性別，除非經毒代動力學研究證明受試物(和其代謝產物)在雄性和雌性無差別和／或如果在確定劑量的預試驗證明有相等毒性。

(4)對單個物種常規(guī)用一種性別(雄性或雌性)，除非預期／證明存在性別差異。第40頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2.年齡和體重

實驗動物同人類一樣，生命全程大體上可區(qū)分三個階段，即幼年期(從出生到性成熟之前)、成年期和老年期。在成年期，各種激素(包括性激素)、代謝酶都處于高峰穩(wěn)定期，并對外源化學物的毒性反應差異較小，且有代表性。在幼年期和老年期，對外源化學物的生物轉運和生物轉化，靶器官和受體的敏感性均與成年期不同。如有報道外源化學物對成年動物的致死劑量(或LD50)與新生動物比較，其比值在0.002～16之間，表明有的外源化學物對新生動物毒性低，也有的毒性反應強。第41頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒理學試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。急性試驗一般選用成年動物;慢性試驗因實驗周期長，應選用較年幼的或初斷乳的動物，以使實驗周期能復蓋成年期。實驗動物的年齡應由其出生日期來定，但實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡，作為挑選適齡動物的依據。同一試驗中，組內個體間體重差異應小于10％，各組間平均體重差異不應超過5％。第42頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.生理狀態(tài)在毒理學試驗中動物如出現妊娠，則影響體重及其他指標的檢測結果，并且，性激素對外源化學物代謝轉化有影響，故應選用未產未孕的雌性動物。雌雄動物應分籠飼養(yǎng)。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及繁殖試驗等，則需有計劃地合籠交配。第43頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.健康狀況實驗動物的健康狀態(tài)對毒理學試驗結果有很大的影響，因此應選用健康動物。健康動物應發(fā)育正常、體形健壯，無外觀畸形，被毛濃密、有光澤、順貼而不蓬亂，行動靈活、反應敏捷，眼睛明亮有神，表皮無潰瘍和結痂，天然孔道干凈無分泌物等。第44頁,共98頁，2024年2月25日，星期天為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察5～7天。對于大鼠和狗的亞慢性和慢性試驗，可在實驗前采血進行血液學和血液生化學檢查，異常的動物應剔除。合理的全營養(yǎng)飼料對維持實驗動物健康和正常的生理活動是至關重要的。高溫與低溫時外源化學物的毒性一般比常溫為高。這種毒性變化可能是由于溫度影響了毒物動力學所致。高溫、高濕環(huán)境共存時皮膚更易于外源化學物經皮膚吸收。第45頁,共98頁，2024年2月25日，星期天人工晝夜周期，即，使動物處于人工調控的12小時白晝(早6點至晚6點)及12小時黑夜(晚6點至次日早6點)，以穩(wěn)定其生物時間節(jié)律。正常、健康的動物每天24小時的生理規(guī)律不盡相同，即存在著生物時間節(jié)律，對外源化學物的毒性反應也有晝夜性時間變化，因此出現毒理學新的分支學科，稱為時間毒理學(Chronotoxicology)。由于動物存在時間節(jié)律，外源化學物在不同時間表現的毒性反應有差別，所以在毒理學實際工作中，尤其是進行亞慢性和慢性染毒時，每日的染毒時間應固定一致，以防止出現時間毒性的影響。而且采取動物生物樣品(如血、尿等)進行各種指標的化驗或一些生理功能的檢查(如血壓、體溫等)也應固定時間。第46頁,共98頁，2024年2月25日，星期天根據我國的法規(guī)和有關規(guī)定，國家實行實驗動物的質量監(jiān)督和質量合格證制度。實驗動物的保種、飼育、供應和應用單位，由各級醫(yī)學動物管理委員會進行定期監(jiān)督、監(jiān)測，并頒發(fā)實驗動物和實驗設施的合格證書(有效期5年)。應用的實驗動物必須有完整的資料。進行動物實驗的人員應經培訓，取得資格認可(上崗證)。實驗動物的飼養(yǎng)設施、環(huán)境條件及飼料等必須符合有關的國家標準。第47頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)食品毒理學試驗設計要點一、體內毒理學試驗設計

1.劑量分組在毒理學試驗中，最重要的就是研究劑量-反應(效應)關系，也就是當外源化學物染毒劑量增加，實驗動物的毒性反應(效應)隨之而增強。劑量-反應(效應)關系的存在是確定外源化學物與有害作用的因果關系的重要依據，也可證明實驗結果的可靠性。因此，在毒理學試驗中，一般至少要設3個劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)，希望能得到滿意的劑量-反應(效應)關系。第48頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一般要求，高劑量組應出現明確的有害作用，或者高劑量組劑量已達到染毒的極限劑量(如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量)。低劑量組應不出現任何可觀察到的有害作用(即相當于NOAEL)，但低劑量組劑量應當高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應出現輕微的毒性效應(即相當于LOAEL)。高、中、低劑量組劑量一般按等比例計算，劑量間距應為2或

，低劑量組劑量一般為高劑量組劑量的1/10～1/20。第49頁,共98頁，2024年2月25日，星期天毒理學試驗常用的對照有4種：

(1)未處理對照組(以前有稱為空白對照組)：即對照組不施加任何處理因素，不給受試物也不給以相應的操作。未處理對照組往往用于遺傳毒理學試驗中，確定指示生物的生物學特征的本底值，進行質量控制。第50頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)陰性對照：不給處理因素但給以必須的實驗因素(溶劑／賦形劑)，以排除此實驗因素(溶劑／賦形劑)的影響，陰性對照作為與染毒組比較的基礎。沒有陰性對照組就不能說明受試物染毒與有害作用之間的關系。例如，在實驗中，染毒各劑量組實驗動物出現某些異常、甚至死亡；如果陰性對照組沒有發(fā)現異常，我們可以認為此種異常和死亡是由于受試物的毒作用；如果陰性對照組也出現同樣的異常和死亡，則應考慮是由于實驗動物患某種傳染病或其他非實驗因素所致，必須重新進行實驗。液體制劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節(jié)劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

第51頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(3)陽性對照：用已知的陽性物(如致突變物)檢測試驗體系的有效性。陽性對照組最好與受試物用相同的溶劑、染毒途徑及采樣時間。在遺傳毒理學試驗、致畸試驗和致癌試驗中都使用了陽性對照組，陽性對照組是用已知的致突變物、致畸物或致癌物染毒，應該得到肯定的陽性結果(即致突變性、致畸性或致癌性)。這是由于這些試驗，特別是遺傳毒理學試驗的變異較大，為了進行質量控制而設置陽性對照組。當同時進行的陰性(溶劑／賦形劑)對照組不能得到陰性結果，陽性對照組不能得到陽性結果，說明此次實驗質量有問題，全部數據無效，必須重新實驗。在遺傳毒理學試驗中，陽性對照與受試物應該用同樣的途徑和溶劑／賦形劑，但如有困難，則不同的染毒途徑、不同溶劑／賦形劑也可以接受。第52頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(4)歷史性對照：由本實驗室過去多次實驗的對照組數據組成，上述三種對照都可構成相應的歷史對照。歷史對照的最好用途是通過同質性檢驗檢查試驗體系的穩(wěn)定性，即進行實驗室質量控制和保證。由于實驗毒理學的各種參數至今尚沒有公認的參考值，因此歷史性對照均值及其范圍在評價研究結果時至為重要。第53頁,共98頁，2024年2月25日，星期天以上所述適用于大多數的毒理學體內試驗。在急性毒性試驗測定LD50或LC50時，劑量組數根據選用的設計和統(tǒng)計學方法而定，可以是4組，也可以是5～7組。根據預實驗結果，希望所設計的中間劑量組的劑量與最后得到的LD50(LC50)接近。由于急性毒性試驗的觀察指標是死亡，并伴有嚴重的中毒癥狀，對于有經驗的實驗者可以不設陰性對照組。當然，如果使用了一種不常用的溶劑或者要測定某種其他的參數如MTD、急性LOAEL和NOAEL，則需要設置陰性對照組。第54頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2.各組動物數毒理學安全性評價試驗各組動物數取決于很多因素，如實驗目的和設計，要求的敏感度、實驗動物的壽命、生殖能力，經濟的考慮及動物的可利用性。各組動物數的設計應考慮到統(tǒng)計學的要求。第55頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.試驗期限某些試驗(如致畸試驗和多代生殖試驗)的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。如急性毒性是一次或1天內多次染毒觀察14天，亞慢性毒性試驗規(guī)定為染毒持續(xù)至實驗動物壽命的10％，對大鼠和小鼠為90天，對狗應為1年。慢性毒性試驗／致癌試驗一般規(guī)定為持續(xù)至實驗動物壽命的大部分。又可分為兩類，即規(guī)定試驗期限的試驗，或直到最敏感的組死亡率達到某一水平(通常為80％)的試驗。第56頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、體外毒理學試驗設計此處簡要討論在遺傳毒理學體外試驗共同考慮的幾個問題。

1．測定受試物溶解性應該測定受試物在試驗介質中的溶解性。已注意到在試驗系統(tǒng)暴露期內，受試物的溶解性可能改變。因此，在試驗開始和結束時評價溶解性是有意義的。溶解性限度就是出現沉淀的最低濃度。第57頁,共98頁，2024年2月25日，星期天2．試驗最高劑量的推薦對可溶性受試物濃度高于10mmol/L時可因高滲透壓在哺乳動物細胞引起損傷或人工假象，對細菌則無此影響。由于受試物的分子量并不一定知道(如聚合物或混合物)，因此，在大多數情況下，可溶性受試物的試驗上限應該是：(1)對哺乳動物細胞為10mmol/L或5mg/ml。(2)對細菌試驗為5mg/平板。當受試物供應困難或非常昂貴(如生物藥劑)，最高劑量低于10mmol/L或5mg/ml(或／平板)是可以接受的。第58頁,共98頁，2024年2月25日，星期天對于有毒性的受試物，最高濃度在細菌試驗中應該是明顯顯示毒性的劑量，對哺乳動物細胞試驗最高劑量，基因突變試驗應達到10％～20％存活率，而染色體畸變和UBS試驗應達到50％存活率。對于沒有適當溶劑，完全不溶的受試物，則可以按5mg/平板或10mmol/L(5mg/ml)進行實驗以檢測雜質的致突變性?；蛘?，采用生理鹽水提取物進行實驗。第59頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.代謝活化代謝活化常規(guī)使用多氯聯苯1254預處理的雄性成年大鼠肝勻漿90000g離心上清液(S9)，及相應的輔因子(NADPH再生系統(tǒng))。由于各國禁用限用多氯聯苯，可用苯巴比妥和β-萘黃酮聯合誘導制備S9(El1iott，1992)。對體外哺乳動物細胞試驗，還可利用大鼠肝原代培養(yǎng)細胞等作為代謝活化系統(tǒng)。第60頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.陽性對照陽性對照的劑量應選擇其劑量-反應的直線部分，并且構成歷史性資料(歷史性對照)，并以其作為實驗質量控制的措施之一。5.重復由質控良好的實驗得到明確的陰性結果和陽性結果，不強調要求重復。可疑結果則應重復實驗，最好改變劑量范圍／劑量間隔、改變S9濃度或改變實驗方法進行重復。第61頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)實驗動物的染毒和處置本節(jié)簡要介紹在動物實驗前的實驗動物準備、受試物的準備、染毒途徑和方法、動物處死和生物標本采集的基本內容。第62頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一、動物實驗前的準備實驗動物在購進之后，應雌雄分開飼養(yǎng)。一般應進行5～7天的檢疫，在此期間應多次觀察動物，及時剔除不健康的動物。觀察期結束，將實驗動物按實驗設計的要求進行標記和分組。第63頁,共98頁，2024年2月25日，星期天實驗動物的標記方法對嚙齒動物常用染色法，可用苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色，不同的顏色和染色部位表示不同的編號，可標出1～99號。由于被毛上顏色會逐步消失，故需重復染色。對嚙齒動物還可用剪耳法標記。對狗等大動物一般用掛牌法。利用耳號鉗在動物的耳朵上打號，每剪一個耳缺代表一個數字，兩個耳朵的耳缺相加所得數字為該動物編號。耳號鉗第64頁,共98頁，2024年2月25日，星期天實驗動物分組的原則要求所有的動物分配到各劑量組和對照組的機會均等，避免主觀選擇傾向，減少偏性，以保證結果的準確可靠。正確的分組方法是隨機分組。實驗動物按性別、體重順序編號，然后利用統(tǒng)計學的隨機數字表，按完全隨機分組法或配伍組隨機分組法，將實驗動物分配到各劑量組和對照組。然后應計算各組實驗動物體重的均值和標準差，必要時可將實驗動物適當調組，以使各組實驗動物體重的均值的差別不超過允許范圍。第65頁,共98頁，2024年2月25日，星期天二、受試物和樣品的準備應了解受試物的純度及雜質成分，了解受試物的化學結構和理化性質，特別是其揮發(fā)性和溶解性。查閱文獻，檢索與受試物化學結構和理化性質相似的化合物的毒性資料，以作參考。對各個毒理學試驗應該用同一種、同一批號受試物。受試物成分和配方必須固定。如是異構體混合物，異構體比例必須固定。活性成分的百分含量和可檢測的雜質的濃度也應固定。受試物在貯存期內穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性必須進行研究并報告。受試物應一次備齊全部實驗的用量。第66頁,共98頁，2024年2月25日，星期天所需受試物總量＝(A×B×C×D)×1.2

式中：A為每組動物數；B為各處理組的劑量和(如0.1+0.3+1.0mg/kg＝1.4mg/kg)；C為染毒次數(通常為天)；D為動物的平均體重；1.2為安全因子，防止損耗。第67頁,共98頁，2024年2月25日，星期天染毒前根據染毒途徑的不同，應將受試物制備成一定的劑型。常用的是制備成水溶液、油溶液或混懸液。對溶劑和助溶劑的要求是，所用的溶劑或助溶劑應該是無毒的，與受試物不起反應，受試物在溶液中應穩(wěn)定。對水溶性受試物，體內試驗適當的溶劑為水(經口染毒)和等滲鹽水(胃腸道外染毒)。水不溶性受試物應溶于或懸浮于適當的有機溶劑中。外源化學物用溶劑稀釋，一般講濃溶液比稀溶液毒性大，但是也有的外源化學物稀釋之后毒性反而增加，即存在所謂“稀釋毒性”，其原因尚不清楚。第68頁,共98頁，2024年2月25日，星期天在準備染毒制劑時的要點：①在準備制劑時加熱受試物不應接近改變其化學性質或物理性質的溫度。②如受試物為固體，并且評價其對皮膚的毒性，應保持其形狀和顆粒大小。③多成分的受試物(混合物)應按配方配制，以使染毒制劑準確地反映原混合物(即其成分不應被選擇性地懸浮或溶解)。④制劑應保持化學穩(wěn)定性和受試物的一致性。⑤制劑應減少總試驗容積，利用溶劑或賦形劑的量不應過多。⑥制劑應易于準確染毒。⑦如可能，制劑pH應為5～9。⑧不應用酸或堿使受試物解離(基于保護動物的原因，并避免改變腸道或腎小管內的PH)。⑨如果應用非胃腸道途徑，終溶液應盡可能接近等滲。第69頁,共98頁，2024年2月25日，星期天對于各種染毒途徑的最大容積，以受試的實驗動物物種或制劑來確定。一般規(guī)定，染毒最大容積為：①經口20ml/kg(對空腹動物);②經皮2ml/kg(根據體表面積計算，限于染毒的準確性)；③靜脈1ml/kg(5分鐘以上)；④肌肉注射0.5ml/kg(一個部位)；⑤每眼0.01ml;⑥直腸0.5ml/kg；⑦陰道：大鼠0.2m1，兔1ml；⑧吸入2mg/L；⑨鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。第70頁,共98頁，2024年2月25日，星期天染毒的通常容積(最大容積)：大鼠灌胃為1.0(3.0)ml／100g體重(BW)，靜注為0.5(3.0)ml／100gBW;小鼠灌胃為0.2(1.0)ml/20gBW，靜注為0.2(0.5)ml/20gBw；狗灌胃為50(100)ml/10kgBw，靜注為30(50)ml／10kgBW。各種規(guī)范可能有不同的規(guī)定，應按規(guī)定進行。第71頁,共98頁，2024年2月25日，星期天三、染毒途徑毒理學試驗中染毒途徑的選擇，應盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經口、經呼吸道、經皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經口＞皮內注射＞其他途徑(如經皮等)。第72頁,共98頁，2024年2月25日，星期天1.經口(胃腸道)染毒常用有灌胃、喂飼和吞咽膠囊等方式。

(1)灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經導管注入胃內。一般灌胃深度從口至劍突下，最好是利用等容量灌胃法，即受試物配制成不同濃度，實驗動物單位體重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時(因小鼠消化吸收和代謝速度較快)，均不停飲水。灌胃后2～4小時提供飼料。經口多次染毒，一般不禁食，但應每日定時染毒。灌胃法優(yōu)點是劑量準確，缺點是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。第73頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至狗的舌后部，迫使動物咽下，此法劑量準確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。(3)喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。飼料中摻入受試物不應超過5％，以免造成飼料營養(yǎng)成分改變而影響實驗動物的生長發(fā)育。喂飼法符合人類接觸受試物的實際情況，但缺點多，如適口性差的受試物，實驗動物拒食；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。第74頁,共98頁，2024年2月25日，星期天

2.經呼吸道染毒經呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內注入。(1)靜式吸入染毒：將一定數量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。一般50升的染毒柜接觸2小時，可放小鼠6～10只或大鼠1只。靜式吸入染毒簡易，但缺點較多，主要是隨試驗進行氧分壓降低(因此，實驗動物數量有限制)，柜內受試物濃度也逐漸下降(由于動物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且實驗動物有經皮吸收的可能。靜式吸入染毒多以計算方法得到染毒柜內受試物濃度，以mg/m3表示。第75頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)動式吸入染毒：由染毒柜、機械通風系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構成。對設備的要求較高，優(yōu)點是在染毒過程中染毒柜內氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定，缺點是消耗受試物的量大，并易于污染環(huán)境。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。動式吸入染毒柜中受試物的濃度應實際監(jiān)測。

(3)氣管內注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。第76頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3.經皮膚染毒經皮膚染毒的目的有兩種。一種是經皮染毒毒性試驗，如經皮LD50測定常用大鼠，皮膚致癌試驗常用小鼠。另一種是皮膚刺激和致敏試驗，皮膚刺激試驗常用兔和豚鼠，皮膚致敏試驗用豚鼠。試驗前用機械法(剃毛)或化學法(硫化鈉或硫化鋇)脫毛。要求是不應損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動物體表面積的10％～15％。于脫毛后24小時涂抹一定量受試物，蓋上一層塑料薄膜，再用無刺激性的膠布固定，接觸規(guī)定的時間。第77頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.注射染毒注射用藥品，應以注射途徑染毒，對大小鼠可用靜脈注射，對非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒，必要時可改為皮下注射。注射染毒，應調整受試物的pH及滲透壓，pH應5～8，最好是等滲溶液，動物對高滲的耐受力比低滲強。靜脈注射應控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。腹腔注射在遺傳毒理學實驗中有時也用，但在致畸試驗、肝UDS研究不應該用腹腔注射，以避免可能的損傷和局部高濃度對靶器官的影響。第78頁,共98頁，2024年2月25日，星期天四、實驗動物處死及生物標本采集1．實驗動物處死方法應盡量減少因處死方法不當而影響對病理及其他指標的檢查。大小鼠可用頸椎脫臼法，然后股動脈放血。兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死。應盡量采用適當的處死方法，減少實驗動物的痛苦。2．血液采集大小鼠如需血量小可用鼠尾采血，如需血量較多可用眼眶靜脈叢采血或處死時股動脈放血采血。狗可用后肢隱靜脈抽血。不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量(50ml/kg體重)的10％。第79頁,共98頁，2024年2月25日，星期天3．尿液采集對大小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器。對狗可用接尿法或導尿法。第80頁,共98頁，2024年2月25日，星期天4.病理解剖和標本留取毒性病理學檢查是毒理學試驗重要的組成部分，病理學研究有助于確定有害作用和靶器官。毒性病理學檢查包括大體解剖和組織病理學檢查兩部分。急性毒性試驗中在試驗期中死亡或試驗結束處死的動物都應進行尸體解剖，因為急性毒性試驗的目的是得到有關可能的靶器官信息以及進行重復染毒試驗劑量設計的信息。在亞慢性、慢性、致癌試驗，病理學是一個重要的終點。第81頁,共98頁，2024年2月25日，星期天（1）大體解剖：在實驗動物處死后半小時內進行，解剖方法采用胸腔、腹腔臟器聯出法。應觀察有關臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質地、切面。對指定的臟器稱重，并計算臟器系數。推薦的實驗動物病理解剖標準操作程序見圖5-1。第82頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共98頁，2024年2月25日，星期天(2)組織病理學檢查：對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切片、HE染色)。應詳細記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。第84頁,共98頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)毒理學實驗結果處理和分析在毒理學試驗的設計和實施中應貫徹實驗設計的對照、隨機和重復的原則，實驗的各劑量組所得到的結果應與陰性對照組比較。根據實驗結果(指標)的變量類型是數值變量(計量資料)還是分類變量(計數資料)，選用不同的統(tǒng)計分析方法。近年來，隨著毒理學的研究方法的發(fā)展，也對生物統(tǒng)計學提出了更高的要求。在評價毒理學試驗的結果時，應綜合考慮生物學意義和統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計檢驗的假設是關于總體特征的假設，檢驗方法是以統(tǒng)計量的抽樣分布為根據的，得到的結論是概率性的，不是絕對的肯定或否定，不等同于有或無生物學意義。對實驗結果作出科學的判斷和解釋，應該根據統(tǒng)計學分析的結果、生物學知識和經驗。第85頁,共98頁，2024年2月25日，星期天一、毒理學試驗的統(tǒng)計學統(tǒng)計學觀點及方法在毒理學試驗的設計和結果評價中起關鍵的作用，毒理學試驗的發(fā)展也促進了生物統(tǒng)計學的發(fā)展。毒理學試驗統(tǒng)計學評價的主要進展是劑量—反應關系研究和對超離差數據的統(tǒng)計。第86頁,共98頁，2024年2月25日，星期天1.毒理學試驗設計的統(tǒng)計學要求毒理學試驗的設計應遵循隨機、重復及對照三個原則，要求各觀察值具有代表性，并且是相互獨立的。毒理學試驗的設計具體涉及到劑量水平數目及間隔，每個劑量點的實驗單位數，每個實驗單位接種及計數的細胞數，對照組的設置等。實驗單位的確定對于樣品的獨立性是很重要的，實驗單位(experimentalunit)是進行處理時或觀察時獨立的最大采樣單位。以動物和培養(yǎng)物作為實驗單位要比以細胞作為實驗單位更為可取。此外，如果同時評價幾個不同因素的效應，應注意均衡的原則。第87頁,共98頁，2024年2月25日，星期天樣本的代表性要求具有同質性，即各處理組和對照組的非實驗因素的條件均一致，為此，各實驗單位(動物或培養(yǎng)物)的分組及整個實驗的全部操作都應遵循隨機化原則。在利用形態(tài)學指標的毒理學試驗，必須采用盲法觀察結果，以消除實驗者觀察結果的偏性。樣本應有足夠的大小和適當的重復次數，以估計處理之間、實驗室內和實驗室間的變異性。一般可根據顯著性水準、檢驗把握度、容許誤差、總體標準差等來估計樣本的大小。嚴格執(zhí)行毒理學試驗設計的上述要求，才可能得到可靠性和重復性良好的結果，也是進行正確的統(tǒng)計學評價的基礎。良好的質量保證和實驗設計可以監(jiān)控系統(tǒng)誤差，而統(tǒng)計處理則用來確定隨機誤差。第88頁,共98頁，202