基因工程原理與技術(shù)專家講座

第八章基因文庫構(gòu)建與目標(biāo)基因取得基因文庫(genelibrary)是指某種生物、組織、或細(xì)胞全部DNA片段克隆群體。包含基因組文庫(genomiclibray)和cDNA文庫(cDNAlibrary)。第一節(jié)基因組文庫構(gòu)建一、理想基因組文庫應(yīng)具備條件1、代表性高，要包含基因組全部DNA序列；2、克隆數(shù)不宜過大，以減輕文庫篩選工作量；

N=ln(1-P)/ln(1-f)N:文庫克隆數(shù);P:篩選目標(biāo)序列概率;

f:插入片段與基因組大小比值3、載體克隆容量要大于基因長度，防止基因被分割克??；4、克隆之間必須存在足夠長度重合區(qū)域以利確定克隆之間關(guān)系?；蚬こ淘砼c技術(shù)專家講座第1頁二、用于構(gòu)建基因組文庫載體

1、λ噬菌體載體

基因工程原理與技術(shù)專家講座第2頁2、黏粒載體

基因工程原理與技術(shù)專家講座第3頁3、酵母人工染色體載體

轉(zhuǎn)化酵母基因工程原理與技術(shù)專家講座第4頁三、基因組文庫構(gòu)建程序1、基因組DNA克隆片段制備①高分子量基因組DNA提?、贒NA克隆片段制備

機械剪切法(移液器抽吸法、超聲波裂解法)：隨機性高，但產(chǎn)生平頭末端DNA片段，連接效率不高。

限制酶消化法(Sau3AI、MboI、HaeⅢ)：有非隨機傾向，但產(chǎn)生黏性末端DNA片段，連接效率高。2、載體DNA片段制備①酶切；普通用BamHI，產(chǎn)生與基因組DNA克隆片段相匹配黏性末端。②堿性磷酸酶處理；

③載體DNA片段純化。有機溶劑抽提乙醇沉淀法、蔗糖密度梯度離心法。

基因工程原理與技術(shù)專家講座第5頁3、基因組DNA片段與載體連接(重組DNA分子構(gòu)建)連接效率主要受插入片段與載體摩爾數(shù)比以及DNA片段總濃度影響。所以，應(yīng)經(jīng)過連接預(yù)試驗確定連接反應(yīng)中載體臂和插入片段用量。

1.0μgλ噬菌體載體臂需要插入片段用量連接效率低處理辦法：①調(diào)整載體與插入片段用量；

②使用新鮮購置連接酶；③重新純化基因組DNA片段；④重新提取和制備基因組DNA片段。

基因工程原理與技術(shù)專家講座第6頁4、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞對于λ噬菌體載體、黏粒載體，重組DNA分子在體外包裝成噬菌體顆粒，以噬菌體感染方式將重組DNA分子導(dǎo)入到大腸桿菌中。效率高，達(dá)1.8×108pfu/μgDNA。對于YAC載體，采取電激法導(dǎo)入重組DNA分子。5、轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)及基因組文庫取得6、基因組文庫擴增、分裝及保留

基因組文庫擴增方法：液體培養(yǎng)增殖法、影印濾膜培養(yǎng)法。

基因組文庫擴增問題：因為克隆不均衡生長，從而造成對應(yīng)克隆丟失，造成基因組文庫代表性變差。小包裝保留，4℃保留六個月、-80℃保留幾年而滴度保持穩(wěn)定。

基因工程原理與技術(shù)專家講座第7頁第二節(jié)cDNA文庫構(gòu)建cDNA文庫是指某生物、組織或細(xì)胞全部cDNA克隆群體。包含組織特異性cDNA文庫、區(qū)域特異性cDNA文庫。一、用于構(gòu)建cDNA文庫載體及載體片段制備質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體，能滿足0.5~10kbcDNA克隆。二、mRNA提取及其完整性確實定1、mRNA起源(取材)目標(biāo)mRNA為高豐度材料2、mRNA提取

olig(dT)n-纖維素柱層析法

olig(dT)n-磁珠分離法基因工程原理與技術(shù)專家講座第8頁3、mRNA完整性確實定無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)檢測法(麥胚抽提物、免網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物)蛙卵檢測法凝膠電泳檢測法(依據(jù)28srRNA與18srRNA條帶亮度判定)4、mRNA富集

尤其是低豐度mRNA。瓊脂糖凝膠電泳法：回收率較低變性蔗糖密度梯度離心法：回收率高現(xiàn)在，普通是進行cDNA富集。操作煩瑣、時間長基因工程原理與技術(shù)專家講座第9頁三、cDNA克隆片段制備1、cDNA第一鏈合成

AAAAAAAAAGppp引物(OligdT17)退火AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT鳥類骨髓細(xì)胞白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶：RNaseH活性強莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶：RNaseH活性較弱，有利于全長cDNA合成。Supscript逆轉(zhuǎn)錄酶：缺失RNaseH活性，反應(yīng)溫度較高(45℃)基因工程原理與技術(shù)專家講座第10頁2、cDNA第二鏈合成

①本身引導(dǎo)合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT煮沸NaOHTTTTTTTTTTTTTTTTTT形成發(fā)夾環(huán)DNA聚合酶TTTTTTTTTAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAS1核酸酶造成5’端缺失基因工程原理與技術(shù)專家講座第11頁②置換合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTRNaseHAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTPolIAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTDNA連接酶優(yōu)點：a、效率高；b、不需純化cDNA第一鏈；c、僅缺失5’端幾個核苷酸?；蚬こ淘砼c技術(shù)專家講座第12頁③PCR合成法

優(yōu)點：a、靈敏度高，對起始材料少、低豐度mRNA尤其含有優(yōu)勢；b、不需純化mRNA，防止了純化過程中信息丟失；c、不會丟失5’端信息基因工程原理與技術(shù)專家講座第13頁3、雙鏈cDNA末端處理及甲基化修飾

①加同聚物尾

基因工程原理與技術(shù)專家講座第14頁②接上人工接頭首先補平cDNA末端及甲基化修飾，然后再接上人工接頭。連接子(linker)基因工程原理與技術(shù)專家講座第15頁銜接頭(adaptor)基因工程原理與技術(shù)專家講座第16頁四、cDNA克隆片段與載體片段連接及檢測1、平頭末端連接法，無法回收插入片段2、同聚物接尾法，接dA/dT，經(jīng)過局部變性和S1處理往返收3、人工接頭法五、重組cDNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞如構(gòu)建質(zhì)粒文庫，要有高質(zhì)量大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(109pfu/μgDNA)六、轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)及cDNA文庫生成七、cDNA文庫擴增、分裝及保留值得注意是：在構(gòu)建cDNA文庫時，假如用人工接頭法，在酶切之前要用甲基化酶保護cDNA中對應(yīng)酶切位點。

普通情況下無需構(gòu)建原核細(xì)菌cDNA文庫。

基因工程原理與技術(shù)專家講座第17頁第三節(jié)目標(biāo)基因取得

取得目標(biāo)基因主要路徑：①篩選基因組文庫；②篩選cDNA文庫；③PCR擴增目標(biāo)基因；④人工合成法；⑤差異克隆法；⑥圖位克隆法；⑦轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法；⑧T-DNA標(biāo)簽法序列已知基因未知序列基因⑨基因組計劃基因工程原理與技術(shù)專家講座第18頁一、從文庫中分離已知序列基因1、核酸雜交法(菌落/噬菌斑原位雜交)

利用部分同源探針能夠分離不一樣種屬相同基因或同一基因家族不一樣組員。

假如只知基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列，能夠設(shè)計簡并探針給予篩選。基因工程原理與技術(shù)專家講座第19頁2、PCR篩選法

特點：快速、簡便。

程序：文庫→多孔培養(yǎng)板

→一列或一行培養(yǎng)物于一PCR管中擴增→凝膠電泳檢測

→陽性列或行分裝培養(yǎng)

→第二輪PCR

→

→

→

→陽性克隆3、免疫學(xué)篩選

特點：篩選表示文庫

程序：與核酸雜交篩選相同。見右圖

基因工程原理與技術(shù)專家講座第20頁二、從文庫中分離未知序列基因1、染色體步移法(圖位克隆法