細(xì)胞凝集反應(yīng)

一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)研究細(xì)胞凝集反應(yīng)方法,了解細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)原因。了解顆粒性抗原與可溶性抗原凝集反應(yīng)原理。細(xì)胞凝集反應(yīng)第1頁(yè)二、試驗(yàn)原理

紅細(xì)胞凝集包含由病毒、細(xì)胞凝集素和抗體而引發(fā)三種類型細(xì)胞凝集現(xiàn)象。凝集素（lectin）是從各種植物種子和動(dòng)物組織中提取糖蛋白或結(jié)合糖蛋白，因?yàn)槟苣t細(xì)胞，故名凝集素。凝集素最大特點(diǎn)是能識(shí)別糖蛋白和糖脂中，尤其是細(xì)胞膜中復(fù)雜碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞表面糖基。經(jīng)過(guò)與細(xì)胞表面糖分子相連，在細(xì)胞間形成橋，從而引發(fā)細(xì)胞凝集。一個(gè)凝集素只對(duì)某一個(gè)特異糖基含有細(xì)胞凝集反應(yīng)第2頁(yè)特異結(jié)合能力，如刀豆素A與吡喃糖基甘露糖結(jié)合，馬鈴薯凝集素專一結(jié)合是N-乙酰氨基葡萄糖二聚體和N-乙酰氨基半乳糖。加入與凝集素互補(bǔ)糖能夠抑制細(xì)胞凝集作用。另外，凝集素還含有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶生物素、鐵蛋白、膠體金結(jié)合而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平免疫細(xì)胞化學(xué)研究。細(xì)胞凝集反應(yīng)第3頁(yè)三、相關(guān)理論知識(shí)

顆粒性凝集反應(yīng)（agglutination）是一個(gè)血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原（完整病原微生物或紅細(xì)胞等）與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合，在有電介質(zhì)存在條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼可見凝集小塊。參加凝集反應(yīng)抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩類。細(xì)胞凝集反應(yīng)第4頁(yè)1.直接凝集反應(yīng)

顆粒狀抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與對(duì)應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。分為玻片法和試管法。1)玻片法是一個(gè)定性試驗(yàn)方法?？捎靡阎贵w來(lái)檢測(cè)未知抗原。若判定新分離菌種時(shí)，可取已知抗體滴加在玻片上，將待檢菌液一滴與其混勻。數(shù)分種后，如出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象，為陽(yáng)性反應(yīng)。該法簡(jiǎn)便快速，除判定菌種外，尚可用于菌種分型、測(cè)定人類紅細(xì)胞ABO血型等。細(xì)胞凝集反應(yīng)第5頁(yè)2)試管法是一個(gè)定量試驗(yàn)經(jīng)典方法?？捎靡阎乖瓉?lái)檢測(cè)受檢血清中有沒有某抗體及抗體含量。用來(lái)幫助臨床診療或供流行病學(xué)調(diào)查研究。操作時(shí)，將待檢血清用生理鹽水連續(xù)成倍稀釋，然后加入等量抗原，最高稀釋度仍有凝集現(xiàn)象者，為血清效價(jià)，也稱滴度，以表示血清中抗體相對(duì)含量。診療傷寒、副傷寒病肥達(dá)氏反應(yīng)（Widaltest）、布氏病瑞特氏反應(yīng)（Wrighttest）均屬定量凝集反應(yīng)。細(xì)胞凝集反應(yīng)第6頁(yè)2.間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一個(gè)與免疫無(wú)關(guān)、一定大小顆粒狀載體表面，然后與對(duì)應(yīng)抗體（或抗原）作用。在有電介質(zhì)存在適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。用做載體微球可用天然微粒性物質(zhì)，如人（O型）和動(dòng)物（綿羊、家兔等）紅細(xì)胞、活性炭顆?；蚬杷徜X顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。因?yàn)檩d體顆粒增大了可溶性抗原反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見反應(yīng)，敏感性比直接凝集反應(yīng)高得多。細(xì)胞凝集反應(yīng)第7頁(yè)四、試驗(yàn)用具1、器材和儀器儀器：電子天平，大燒杯，小燒杯，顯微鏡，移液器，離心機(jī)，玻璃棒，鑷子。耗材：10ml小試劑瓶，載玻片，蓋玻片，1.5ml離心管，擦鏡紙，吸頭。2、材料：馬鈴薯塊莖、雞血細(xì)胞凝集反應(yīng)第8頁(yè)2、試驗(yàn)試劑：PBS緩沖液：稱取7.2gNaCl，1.48gNaH2PO4，0.46gKH2PO4，用蒸餾水定容至1000ml，調(diào)pH為7.2。生理鹽水：稱取0.9gNaCl加水定容至100ml。3.8%檸檬酸鈉溶液：稱取3.8g檸檬酸鈉（或是4.33g帶結(jié)晶水檸檬酸鈉）加水定容至100ml。細(xì)胞凝集反應(yīng)第9頁(yè)五、試驗(yàn)步驟

1、凝集素制備：用1/100電子天平稱取2g去皮土豆塊莖，加10mlPBS緩沖液在燒杯中浸泡2h，粗提液中即含有土豆凝集素。2、2%雞血紅細(xì)胞制備①用燒杯取5ml3.8%檸檬酸鈉溶液，取一只雞雞血于燒杯中，不停輕輕攪拌預(yù)防血凝。（注：一只雞血大約50ml左右，按10%用量加入3.8%檸檬酸鈉。）細(xì)胞凝集反應(yīng)第10頁(yè)②用1.5ml離心管取血液1ml，rpm離心5min，用移液器輕輕吸收上清去除；加入1ml生理鹽水清洗紅細(xì)胞，rpm離心5min，重復(fù)洗2—3次（注：從離心機(jī)內(nèi)拿出離心管時(shí)切勿震蕩，不要傾倒離心管倒上清，以免紅細(xì)胞流出。清洗紅細(xì)胞時(shí)用移液器緩緩抽打，預(yù)防紅細(xì)胞破裂）。細(xì)胞凝集反應(yīng)第11頁(yè)③在小試劑瓶中加入9.8ml生理鹽水，用移液器吸收200μl血紅細(xì)胞加入小試劑瓶中，混勻，即是2%紅細(xì)胞懸液，貼上標(biāo)簽備用（注：吸收紅細(xì)胞加入試劑瓶時(shí)可吸收生理鹽水清洗幾次吸頭，使得紅細(xì)胞全部在懸液中）。細(xì)胞凝集反應(yīng)第12頁(yè)凝集反應(yīng)現(xiàn)象用移液器吸收紅細(xì)胞懸液，在三片載玻片上各滴一滴，其中一片加一滴土豆凝集素，一片再加一滴PBS緩沖液，充分混勻，另外一片只有紅細(xì)胞懸液做空白對(duì)照，蓋上蓋玻片，待干后于顯微鏡下觀察血細(xì)胞凝集現(xiàn)象（注：紅細(xì)胞懸液放置一段時(shí)間會(huì)發(fā)生沉降，取用之前應(yīng)該輕輕搖勻）。細(xì)胞凝集反應(yīng)第13頁(yè)六、試驗(yàn)結(jié)果與分析

1、肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果圖1左邊是血紅細(xì)胞加PBS緩沖液；中間是血細(xì)胞加凝集素；右邊是血紅細(xì)胞懸液（如圖1所表示，加土豆凝集素血紅細(xì)胞在肉眼下顯著能夠看到紅細(xì)胞發(fā)生凝集，未加土豆凝集素紅細(xì)胞則沒有改變，加入PBS緩沖液紅細(xì)胞能夠保留時(shí)間較長(zhǎng)。）細(xì)胞凝集反應(yīng)第14頁(yè)2、顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞凝集反應(yīng)第15頁(yè)雞血紅細(xì)胞(非哺乳類)未凝血細(xì)胞凝集反應(yīng)第16頁(yè)凝血細(xì)胞凝集反應(yīng)第17頁(yè)圖2左圖為紅細(xì)胞未發(fā)生凝集，右圖為加入土豆凝集素紅細(xì)胞發(fā)生凝集如圖左所表示，顯微鏡下觀察到紅細(xì)胞是分散；加入土豆凝集素后紅細(xì)胞就發(fā)生凝集，因?yàn)樵S多紅細(xì)胞凝集，重合一起使得顏色變得更深。細(xì)胞凝集反應(yīng)第18頁(yè)七、注意事項(xiàng)及改進(jìn)（1）離心機(jī)使用時(shí)，要將配平后離心管對(duì)稱放置在離心機(jī)內(nèi)，禁止未配平就放入離心機(jī)和非對(duì)稱放置離心管。（2）從離心機(jī)內(nèi)拿出離心管時(shí)切勿震蕩，不要傾倒離心管倒上清，以免紅細(xì)胞流出。清洗紅細(xì)胞時(shí)用移液器緩緩抽打，預(yù)防紅細(xì)胞破裂。（3）紅細(xì)胞懸液放置一段時(shí)間會(huì)發(fā)生沉降，取用之前應(yīng)該輕輕搖勻。（4）紅細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間放置后，滴在載玻片上干了細(xì)胞輕易破裂，會(huì)影響試驗(yàn)觀