DB11∕T 2023-2022 魚類貝類環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范

北DB11北京市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布 1 1 1 2 2 4 5 5 6 7 8 9 I魚類貝類環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)從生物生活環(huán)境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含動(dòng)植物脫落的細(xì)胞或游離的DNA，可一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，包括變性、退火、延1般把堿基序列相似度不小于97%的OTU定義為為高通量測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣點(diǎn)來(lái)源的物種基因序列，在擴(kuò)增引物5’端增加的序列特異性短片段標(biāo)除非另有說(shuō)明，試劑均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，試?yàn)用水均使用——消毒液：次氯酸鈉和蒸餾水配制，有效氯濃度）；2）；）；）；）；）；——酚氯仿：Tris飽和酚、氯仿和異戊醇按25:2——乙酸銨（CH3COONH4）；——脫氧核糖核苷三磷酸：脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥(niǎo)嘌呤三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧胞苷三），）；）；3c)水庫(kù)型水體：入庫(kù)河口區(qū)應(yīng)設(shè)置采樣點(diǎn)，庫(kù)區(qū)每15km2~20km2設(shè)置d)河流型水體：參照SL219中水質(zhì)監(jiān)測(cè)斷面布設(shè)原則設(shè)置采樣斷面；對(duì)魚類eDNA樣品，在采46.2.2離岸樣點(diǎn)：魚類eDNA樣品在水深<10m處水面下0.5m采集，水深≥10m處分水面下0.5m和水底上1m兩個(gè)水層等比采集混合水樣；貝類eDNA樣品在水底6.2.3采樣瓶裝滿后應(yīng)密封并做好標(biāo)記，置于車載冰箱7.2.1連接真空泵和抽濾器，用鑷子取0.45μm孔徑的混合纖維素酯濾膜置于玻璃濾膜臺(tái)中央，蓋上c)將裂解液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)編號(hào)的新離心管中，加入等體積Tris飽e)轉(zhuǎn)移上清液到對(duì)應(yīng)編號(hào)的新離心管中，5j)使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度和質(zhì)量，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完選擇魚類線粒體特定通用擴(kuò)增引物對(duì)eDNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物核苷酸下游引物R：CATAGTGGGGTATC選擇貝類線粒體特定通用擴(kuò)增引物對(duì)eDNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物核苷酸上游引物F：GGWACWGGWTGAACWGTW可參考附錄A中列出的8堿基條形碼參考序列進(jìn)行添加，也可根據(jù)情況自行設(shè)計(jì)添加。不影響擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系包括PCR聚合酶、聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、經(jīng)8.1和8.2提6對(duì)PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行第二代高通量測(cè)序，利用分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除測(cè)序過(guò)程b)去除讀長(zhǎng)上的引物序列，去除錯(cuò)配擴(kuò)增序列，此步驟處理后一般僅留存35~45%的序列；e)去除由于測(cè)序讀長(zhǎng)限制導(dǎo)致的末端序列不穩(wěn)定的部分堿基，即序列末端的5bp~20bp；f)將前后兩端的讀長(zhǎng)拼接成一條完整的序列，最低重疊堿基數(shù)一般設(shè)置為20bp；g)將拼接的序列進(jìn)行去重復(fù)處理并排序，即刪除相同的序列，每個(gè)序列僅保留一條；i)將篩選和處理后的結(jié)果輸出fasta格式的序列文件保存。a)經(jīng)篩選與處理的測(cè)序數(shù)據(jù)需使用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件基于97%序列相似度進(jìn)行聚類，獲果界門綱目科屬種1...78b)樣品采集完成后置于4℃保存、運(yùn)輸并確保在24h內(nèi)完成抽濾，濾膜在a)抽濾所用器具規(guī)范滅菌和清洗，避c)DNA提取和純化所用器具按規(guī)范滅菌，耗材一次性使用，避免交叉污染。9123456789[1]HJ710.8-2014生物多樣性觀測(cè)技[3]D