禽曲霉菌病診斷技術(shù)

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)禽曲霉菌病診斷技術(shù)2002-08-27發(fā)布中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布1禽曲霉菌病(avianaspergillosis)是多種禽類、哺乳動物和人畜共患的一種真菌病。主要侵害呼吸系統(tǒng)，在肺和氣囊發(fā)生炎癥和小結(jié)節(jié)，導(dǎo)致呼吸困難，甚至窒息死亡。病原體主要為曲霉屬(Aspergillus)中的煙曲霉(A.fumigatus)和黃曲霉(A.flavus),其次為構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)和土曲霉(A.terreus)等。本病發(fā)生于世界各地，對雛雞的危害最大，可引起幼雛大批死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。對曲霉菌病的診斷，近年來提出了一些新技術(shù)。但是，各國確定的常用方法，仍是本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的病理學(xué)檢查和病原學(xué)檢查。病理學(xué)檢查(包括在病變組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)曲霉菌)可以確定病性，病原學(xué)檢查不僅可以提高診斷率，而且能夠鑒定曲霉菌菌種。國際上無相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范可供參照。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，對提高我國禽曲霉菌病的診斷水平，保證養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展，將起到重要的作用。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國人民解放軍軍需大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宣華、向華。1禽曲霉菌病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽曲霉菌病病理學(xué)和病原學(xué)檢查的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽(鳥)類曲霉菌病的診斷和檢疫。2病理學(xué)檢查2.1材料準(zhǔn)備2.1.1器材小動物解剖器具，滅菌試管(供采集真菌學(xué)檢查樣品用),普通顯微鏡等。2.1.2試劑體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液，30%甘油緩沖溶液，其配方見附錄A。2.2尸體剖檢方法按照常規(guī)的禽類尸體剖檢術(shù)式，將可疑病禽的各內(nèi)臟器官取出，逐一檢查。重點(diǎn)檢查呼吸系統(tǒng)。如發(fā)現(xiàn)可疑病變，先取1份置于無菌中試管內(nèi)或30%甘油緩沖溶液(見第A.1章)中，供病原學(xué)檢查用，再取1份置入10%甲醛溶液內(nèi)，供病理組織學(xué)檢查用。2.3主要病理變化禽曲霉菌病的病變主要見于呼吸系統(tǒng)，在肺臟和氣囊形成數(shù)量不等、粟粒大至綠豆粒大的結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)質(zhì)地較硬，切面呈同心圓輪層狀。顯微鏡檢查，見結(jié)節(jié)周邊為淋巴細(xì)胞、多核巨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)表面也能發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)節(jié)或菌斑病變。3病原學(xué)檢查3.1材料準(zhǔn)備3.1.1器材3.1.2試劑20%氫氧化鉀溶液，乳酸酚棉藍(lán)染色液，沙保勞(Sabouraud)氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或改良察貝克(Czapek)氏瓊脂培養(yǎng)基等，其配制方法見附錄A。3.1.3樣品采集對病理學(xué)檢查可疑的病禽，應(yīng)無菌操作采取帶有病變(如結(jié)節(jié)、霉菌斑等)的組織各數(shù)小塊，置于滅菌容器(如中試管)內(nèi)冷藏，并盡快送檢，如果不能立即送檢，可暫時保存于30%甘油緩沖液中。3.2檢查方法3.2.1壓滴標(biāo)本法取結(jié)節(jié)置于載玻片上，用手術(shù)刀切開，由切面刮取干酪樣壞死組織，或由病變組織表面刮取霉菌斑，或用鉑金針鉤取純培養(yǎng)物置于載玻片中央，加1～2滴乳酸酚棉藍(lán)染色液或生理鹽水，用大頭針將組織塊或菌團(tuán)撕扯開，壓上蓋玻片(注意勿產(chǎn)生氣泡),制成壓滴標(biāo)本。如果組織碎塊較硬，可改用1～2滴220%氫氧化鉀(KOH)溶液，并在火焰上微微加溫后壓片。顯微鏡檢查時，先用低倍物鏡發(fā)現(xiàn)目標(biāo)，再用高倍物鏡詳細(xì)觀察菌體形態(tài)。經(jīng)棉藍(lán)(見第A.2章)染色的菌體呈藍(lán)色。3.2.2分離培養(yǎng)法取沙保勞(Sabouraud)氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(見第A.3章)或改良察貝克氏瓊脂(見第A.4章)培養(yǎng)皿若干個(通常每份樣品用4個),做好標(biāo)記。將鉑金耳在火焰上燒灼滅菌，冷卻后鉤取干酪樣壞死組織或霉菌斑，均勻涂抹于培養(yǎng)基表面；或者用鉑金針蘸取樣品，小塊點(diǎn)播刺種于培養(yǎng)基表層。接種完畢，將鉑金耳或針在火焰上燒灼滅菌，將接種過的培養(yǎng)皿放在27℃或37℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。通常于36h后即可見菌落出現(xiàn)。菌落形態(tài)見附錄B(B.2.1.1,B.2.2.1,B.2.3.1,B.2.4.1和B.2.5.1)。4結(jié)果判定在可疑病禽(鳥)的病變組織中，觀察到或分離出曲霉菌，即可確診為禽曲霉菌病。如要確定為何種曲霉菌所感染，則需參照附錄B,依據(jù)菌落和菌體的形態(tài)特征，對所分離的曲霉菌進(jìn)行菌種鑒定。3(規(guī)范性附錄)主要試劑的配制方法A.1質(zhì)量濃度為30%的甘油緩沖液甘油(化學(xué)純)磷酸氫二鈉(Na?HPO?)蒸餾水加至100.0mL先用少量蒸餾水溶解氯化鈉和磷酸氫二鈉，再加入甘油，最后用蒸餾水補(bǔ)足量，混合，分裝，于103.6kPa滅菌15min～20min后保存?zhèn)溆?。A.2乳酸酚棉藍(lán)染色液結(jié)晶石炭酸20.00g乳酸20.00mL甘油40.00mL棉藍(lán)0.05g蒸餾水20.00mLA.3沙保勞(Sabouraud)氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖40g蛋白胨10g瓊脂粉18g～20g蒸餾水1000mL將以上成分倒入燒杯或三角燒瓶內(nèi)，先加少量蒸餾水加熱溶解。待完全溶解后補(bǔ)足蒸餾水至所需要的總體積，并加入氯霉素50μg/mL～100pg/mL,用四層紗布過濾，按要求定量分裝于小燒瓶或中試管內(nèi)，塞以棉塞，再于棉塞外加包牛皮紙和油紙各一層，掛上標(biāo)簽，于103.6kPa滅菌10min～15min后保存?zhèn)溆?。A.4改良察貝克(Czapek)氏瓊脂培養(yǎng)基蔗糖磷酸二氫鉀(KH?PO?)硫酸鎂(MgSO?)氯化鉀(KCl)硫酸亞鐵(FeSO,·7H?O)瓊脂粉配制法同A.3。4(規(guī)范性附錄)禽曲霉菌病有關(guān)的曲霉菌的鑒別要點(diǎn)B.1概述引起禽曲霉菌病的病原體主要為煙曲霉和黃曲霉，其次為構(gòu)巢曲霉、黑曲霉和土曲霉等，這些曲霉菌都具有如下共同的形態(tài)結(jié)構(gòu)：b)分生孢子梗：由特化的膨大而厚壁的菌絲細(xì)胞(即足細(xì)胞)的中部向上叉生而成；e)分生孢子：成串排列于小梗的游離端。但是，不同的菌種在這些結(jié)構(gòu)的形態(tài)上又有明顯的不同。根據(jù)這些不同點(diǎn)，特別是分生孢子頭(頂囊、小梗、分生孢子三部分的合稱)的特征，結(jié)合菌落的形態(tài)和顏色，可將這幾種曲霉菌區(qū)別開。禽曲霉菌病中常見曲霉菌形態(tài)見圖B.1。5ABDCEB——黃曲霉；D——黑曲霉；E土曲霉。圖B.1禽曲霉菌病中常見曲霉菌形態(tài)比較示意圖煙曲霉在沙保勞氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，發(fā)育很快。開始菌落呈白色絨毛樣或棉花絲樣，3d～4d內(nèi)，菌落中心變?yōu)闊熅G色或深綠色，表面微細(xì)粉末狀或絨毛樣(形成大量分生孢子之故)。菌落背面無色或略帶黃褐色。在察貝克氏培養(yǎng)基上，生長旺盛，菌落呈絨毛狀，氣生菌絲直立而豐富，分生孢子頭初呈白色或微帶藍(lán)色，有呈綠色者，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?。菌落背面無色或呈黃色，老菌落則可呈暗紅色。6B.2.1.2菌體形態(tài)參見圖B.1中A。d)分生孢子：球形或近球形，直徑2.5μm～3.0μm,表面粗糙有細(xì)刺，帶綠色；B.2.2黃曲霉(Aspergillusflavus)B.2.2.1菌落形態(tài)菌落生長迅速，至10d～14d時，直徑可達(dá)3cm～7cm。初似黃色粉末，繼而密集隆起，變?yōu)辄S綠色，日久則成棕綠色。表面平坦或有放射狀溝紋。菌落背面無色或帶褐色。B.2.2.2菌體形態(tài)參見圖B.1中Ba)分生孢子梗：長約400μm～1000μm,寬約10μm～20μm,微彎曲，梗壁極粗糙，近頂囊處略c)小梗：單層、雙層或單層雙層并存于一個頂囊上，但以雙層者居多。?；L約7μm～10μm,寬d)分生孢子：球形、近球形或梨形，直徑約3.5μm～6.0μm,表面粗糙；e)菌核：有些菌系產(chǎn)生褐色菌核。B.2.3構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)B.2.3.1菌落形態(tài)在察貝克氏瓊脂培養(yǎng)基上于27℃下培養(yǎng)，菌落生長快速，至14d時直徑達(dá)5cm～6cm。最初為光紅色。當(dāng)閉囊殼形成時，菌落中心向外長出一些小白點(diǎn)，菌落呈黃褐色。B.2.3.2菌體形態(tài)參見圖B.1中C。a)分生孢子梗：極短(長約75μm～100μm,寬約3.5μm～5.0μm),常有波狀彎曲，近頂囊處稍c)小梗：雙層，?；?長約5μm～6μm,寬約2μm),分布于頂囊的頂部，呈放射狀排列；瓶梗長e)閉囊殼：為該菌有性階段的產(chǎn)物，球形，直徑約135μm～150μm,略呈紫紅色，內(nèi)含子囊孢子。成熟的閉囊殼被淡黃色的殼細(xì)胞所包圍。B.2.4黑曲霉(Aspergillusniger)B.2.4.1菌落形態(tài)在察貝克氏瓊脂培養(yǎng)基上于25℃下培養(yǎng)，菌落擴(kuò)展迅速，至10d～14d直徑可達(dá)2.5cm～3.0cm。初期有豐富的白色羊毛狀氣生菌絲，并常出現(xiàn)鮮黃色區(qū)域，繼而變成粗絨狀，黑色、黑褐色。菌落背面無B.2.4.2菌體形態(tài)a)分生孢子梗：長約200μm～400μm,也有長達(dá)1000μm以上者，寬約10μm～20μm,壁厚、光滑，無色或梗的上部稍帶黃色；c)小梗：雙層，緊密排列于整個頂囊表面，呈放射狀，褐色。?；s400～500個，每個?；L約20μm～30μm,寬約5μm～6μm,有時更寬并具有橫隔；瓶梗較短，長約7μm～10μm,寬約B.2.5土曲霉(Aspergillusterreus)B.2.5.