人工合成多聚核苷酸體外翻譯技術(shù)

關(guān)于人工合成多聚核苷酸體外翻譯技術(shù)第2頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天參與翻譯的RNA分子有tRNA、rRNA和mRNA。tRNA的功能是轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，rRNA與多種蛋白質(zhì)組成核糖體作為翻譯進(jìn)行的場(chǎng)所，mRNA作為翻譯的模板。經(jīng)過(guò)三種RNA以及多種蛋白質(zhì)的相互作用，使來(lái)自DNA的遺傳信息正確地傳遞到蛋白質(zhì)。第3頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)遺傳密碼一、遺傳密碼遺傳密碼（geneticcode）是聯(lián)系核酸的堿基序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列的途徑。mRNA上由三個(gè)堿基代表一種氨基酸，稱為密碼子（codon）。生物體內(nèi)存在多個(gè)密碼子代表一種氨基酸的情況。第4頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天1954年，物理學(xué)家GeorgeGamov根據(jù)在DNA中存在四種核苷酸，在蛋白質(zhì)中存在二十種氨基酸的對(duì)應(yīng)關(guān)系，提出三個(gè)核苷酸為一個(gè)氨基酸編碼是最理想的。因?yàn)樵谟兴姆N核苷酸的條件下，64（43=64）是能滿足為20種氨基酸編碼的最小數(shù)，這也符合生物體在億萬(wàn)年進(jìn)化過(guò)程中形成的和遵循的經(jīng)濟(jì)原則。第5頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天密碼子的破譯是分子生物學(xué)發(fā)展史上的一件大事。主要運(yùn)用了兩項(xiàng)技術(shù)，一項(xiàng)是1961年由Nirenberg等報(bào)道的人工合成多聚核苷酸體外翻譯技術(shù)；另一項(xiàng)是1964年Nirenberg和Leder發(fā)明的核糖體結(jié)合技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)，為密碼子的破譯奠定了基礎(chǔ)。第6頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

破譯密碼的實(shí)驗(yàn)研究先后由三個(gè)實(shí)驗(yàn)室逐步發(fā)展了四種破譯方法，于1965年完成。

1)在體外無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系中加入人工合成的polyＵ開(kāi)創(chuàng)了破譯遺傳密碼的先河。1961年，美國(guó)NIH的Nirenberg和Mathaei第一次確認(rèn)了UUU是Phe的密碼子。隨后他們又確定了AAA是Lys的密碼子，CCC是Pro的密碼子。第7頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2)混合共聚物(mixedcopolymers)實(shí)驗(yàn)對(duì)密碼子中堿基組成的測(cè)定

1963年，Speyer和Ochoa等發(fā)展了用兩個(gè)堿基的共聚物破譯密碼的方法。例如以A和C原料，合成polyAC。但這個(gè)方法不能確定堿基的排列方式，而只能顯示密碼子中堿基組成及組成比例。另外，通過(guò)反復(fù)改變共聚物成份比例的方法亦十分麻煩和費(fèi)時(shí)。

第8頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3)aa-tRNA與確定的三核苷酸序列(密碼子)結(jié)合（核糖體結(jié)合技術(shù)）

Nirenberg和Leder于1964年建立了破譯密碼子的新方法，即tRNA與確定密碼子結(jié)合實(shí)驗(yàn)。即是在缺乏蛋白質(zhì)合成所需的因子的條件下，特異氨基酸-tRNA(aa-tRNA)也能與核糖體-mRNA復(fù)合物結(jié)合。最重要的是這種結(jié)合并不一定需要長(zhǎng)的mRNA分子。但有一些三核苷酸序列與核糖體結(jié)合并不象UUU或GUU等那樣有效。第9頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第10頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天4)用重復(fù)共聚物(repeatingcopolymers)破譯密碼

Jones，和Khorana等人應(yīng)用有機(jī)化學(xué)和酶學(xué)技術(shù)，制備了已知的核苷酸重復(fù)序列。蛋白質(zhì)在核糖體上的合成可以在這些有規(guī)律的共聚物的任一點(diǎn)開(kāi)始，并把特異的氨基酸參入肽鏈。例如，重復(fù)序列CUCUCUCUCU......是多肽Leu-Ser-Leu-Ser......或者是多肽Ser-Leu-Ser......的信使分子。第11頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天除甲硫氨酸和色氨酸外，其他的氨基酸均有兩種以上的密碼子。多種密碼子編碼一種氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并（degeneracy），代表同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonyms）。氨基酸的密碼子數(shù)目和它在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的頻率并沒(méi)有明顯的正相關(guān)性。第13頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第14頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天一種氨基酸的幾個(gè)密碼子的差異通常在第三個(gè)堿基，說(shuō)明了密碼子的第三個(gè)堿基具有一定的靈活性。在所有的生物體內(nèi)，密碼子字典幾乎是通用的，這已被體內(nèi)和體外的翻譯實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。第15頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第17頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天線粒體的遺傳密碼子存在較多的例外情況，其中最常見(jiàn)的一種變化是UGA由終止密碼子變?yōu)樯彼岬拿艽a子，這可能是進(jìn)化上最早期的變化。第18頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、密碼子和反密碼子的相互作用密碼子決定氨基酸是通過(guò)mRNA與tRNA相互作用實(shí)現(xiàn)的，這種作用實(shí)質(zhì)上是堿基間的配對(duì)。密碼子與反密碼子（anticodon）間的正確識(shí)別是遺傳信息正確傳遞的保證。第19頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天一般來(lái)說(shuō)，生物體內(nèi)tRNA的種類要少于編碼氨基酸的密碼子。密碼子的前兩位堿基在和反密碼子配對(duì)時(shí)遵循Watson-Crick原則，而第三位堿基則有一定的靈活性，這就是擺動(dòng)假說(shuō)（wobblehypothesis）。第20頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天在不同生物體內(nèi)，存在多種方式使少數(shù)的tRNA識(shí)別61種編碼氨基酸的密碼子，不同的生物所采用的途徑也不同。tRNA分子中含有較多的修飾堿基。位于反密碼子中的或其他位置的修飾堿基均會(huì)對(duì)密碼子和反密碼子的作用產(chǎn)生影響。第22頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第23頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二套密碼系統(tǒng)的概念和特征1988年，ChristiandeDuve在Hou和Schimmel等人的研究基礎(chǔ)上，提出了第二套密碼系統(tǒng)的概念或?qū)W說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為:tRNA氨基酸接受柄有一輔密碼區(qū)(paracodonregion)，可以被氨基酰tRNA合成酶(aaRS)識(shí)別，并決定tRNA的負(fù)載特異性。他認(rèn)為第二套密碼系統(tǒng)蘊(yùn)含于aaRS結(jié)構(gòu)中。第24頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天與經(jīng)典密碼系統(tǒng)不同。輔密碼子密碼系統(tǒng)或第二套密碼系統(tǒng)是非簡(jiǎn)并性的(non-degenerate)。可能只有20種aaRS，每種aaRS能夠識(shí)別特異于某種氨基酸的所有tRNA，這種識(shí)別與該種特異tRNA的不同特征有關(guān)。第二套密碼系統(tǒng)比經(jīng)典的密碼系統(tǒng)對(duì)氨基酸更具有決定性，這與輔密碼子和相應(yīng)的氨基酸間的立體化學(xué)相互反應(yīng)有關(guān)。

第25頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天ChristiandeDuve認(rèn)為，第二套密碼系統(tǒng)僅僅是輔密碼子與aaRS-aa-AMP或aa-aaRS復(fù)合物的一個(gè)簡(jiǎn)單反應(yīng)，而tRNA則起著刪除錯(cuò)誤氨基酰的作用。aaRS上的某些區(qū)域含有一些殘基可與輔密碼子的核苷酸反應(yīng)，但無(wú)法把所有氨基酸側(cè)鏈與tRNA的核苷酸匹配起來(lái)。因此，一些科學(xué)家提出第二套密碼系統(tǒng)存在于tRNA分子本身，而不應(yīng)存在于aaRS結(jié)構(gòu)中。第26頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二套密碼系統(tǒng)比經(jīng)典的密碼系統(tǒng)更原始。一些作者猜測(cè)tRNA起源于攜帶氨苷酰的寡核苷酸，其原始形式能與氨基酸直接反應(yīng)。破譯第二密碼系統(tǒng)的意義不僅僅限于tRNA分子本身生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，更重要的是將對(duì)生物化學(xué)，生物起源，分子生物學(xué)及遺傳學(xué)產(chǎn)生重大影響。

第27頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)tRNA的功能所有的tRNA都有相同的二級(jí)（三葉草型）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（倒L型）。這種結(jié)構(gòu)上的一致性是其功能所必需的。因?yàn)椴煌膖RNA分子都具有相同的功能特征。tRNA在翻譯中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用，將氨基酸經(jīng)過(guò)密碼子與反密碼子的相互識(shí)別定位在肽鏈中。從這一點(diǎn)上看，tRNA是起具體翻譯作用的分子。第28頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第29頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第32頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第33頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、氨酰tRNA合成酶氨酰tRNA合成酶催化氨基酸與tRNA之間的反應(yīng)。攜帶同一種氨基酸的tRNA可有多種，稱為同工tRNA（iso-acceptingtRNA）?？蓪RNA分為20個(gè)同工tRNA組。一組同工tRNA在特定的合成酶催化下與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合。第35頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天氨酰tRNA合成酶有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，分別是氨基酸結(jié)合位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)和tRNA結(jié)合位點(diǎn)。它催化的反應(yīng)可分為兩步：第一步氨基酸和ATP形成腺苷酸化氨基酰，釋放焦磷酸；第二步活化型的氨基酸被轉(zhuǎn)移至tRNA，釋放AMP。氨酰tRNA合成酶所催化的反應(yīng)有特異性，即能選擇相應(yīng)的tRNA和氨基酸。一種合成酶只能識(shí)別一種氨基酸和該氨基酸的幾種同工tRNA。第36頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第37頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第38頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第39頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第40頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第41頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第42頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第43頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第44頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第45頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天tRNA沿著L型的一面與合成酶結(jié)合。所有的tRNA均是以兩個(gè)端點(diǎn)與合成酶結(jié)合，大部分的序列不被合成酶識(shí)別。第一類和第二類合成酶與tRNA的相互作用有所區(qū)別。經(jīng)晶體結(jié)構(gòu)分析，兩類酶與tRNA接觸的方位正好相反，所形成的復(fù)合物互成鏡像結(jié)構(gòu)。第46頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第47頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第48頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第49頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第50頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)核糖體的結(jié)構(gòu)核糖體（ribosome），又稱核糖核蛋白顆粒（ribonucleoproteinparticle），是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，在蛋白質(zhì)合成中起著中心作用。核糖體提供了蛋白質(zhì)合成過(guò)程中所需的各種生物活性。第51頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、核糖體的組成原核生物、真核生物和細(xì)胞器的核糖體組成差別很大，但其三維結(jié)構(gòu)非常相似。不論何種來(lái)源的核糖體，均由大小兩個(gè)亞基組成。兩個(gè)亞基均由RNA和一定數(shù)量的蛋白質(zhì)組成，其共同特征是RNA的含量比蛋白質(zhì)高。第52頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第53頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天核糖體RNA（rRNA）的純化相對(duì)比較容易，可以用苯酚抽提核糖體以去除蛋白質(zhì)而獲得。rRNA的大小可以通過(guò)超速離心來(lái)確定。核糖體蛋白則是非常復(fù)雜的混合物，其純化和分子量的大小只能用更為精細(xì)的辦法來(lái)確定。1970年，E.Kaldschmidt和H.G.Wittman用雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）的辦法對(duì)組成兩個(gè)亞基的蛋白進(jìn)行了近乎完全的解析。

第54頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第55頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第56頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第57頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第58頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第59頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第60頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第61頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌70S核糖體由30S小亞基和50S大亞基兩部分組成。30S小亞基由一個(gè)16SrRNA和21種核糖體蛋白組成，而50S大亞基則含有兩個(gè)rRNA（5S和23S）和34種核糖體蛋白。真核生物細(xì)胞質(zhì)核糖體更為復(fù)雜，沉降系數(shù)為80S，由40S小亞基和60S大亞基組成。40S小亞基由18SrRNA和33種蛋白組成，而60S大亞基則含有三個(gè)rRNA分子（5S，5.8S和28S）和50種核糖體蛋白。第62頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第63頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天組成核糖體的RNA和蛋白質(zhì)一般只有一個(gè)拷貝。RNA和蛋白質(zhì)相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜而有序的結(jié)合體。核糖體的數(shù)目與生物合成蛋白質(zhì)的活性密切相關(guān)。第64頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、核糖體的結(jié)構(gòu)核糖體的直徑只有可見(jiàn)光波長(zhǎng)的十分之一。因此，單個(gè)的核糖體不能反射可見(jiàn)光，我們也就不能在光學(xué)顯微鏡下看到核糖體。

20世紀(jì)70年代，JamesLake（1976）利用負(fù)染色電鏡技術(shù)（negativestainingtechniques）不僅觀察到了核糖體兩個(gè)亞基的形狀，還得到了在完整的核糖體內(nèi)它們是如何配合在一起的信息。第65頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第66頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第67頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第68頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天30S核糖體亞基結(jié)構(gòu)包括頭（head）、基部（base）、平臺(tái)（platform）以及縫隙（cleft）等；50S核糖體亞基的結(jié)構(gòu)包括中央突（centralprotuberance）、莖（stalk）、嵴（ridge）以及谷（valley）等。核糖體30S小亞基的平臺(tái)伸入到50S大亞基的谷中而嵌和在一起。游離狀態(tài)和蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的核糖體結(jié)構(gòu)有區(qū)別，說(shuō)明核糖體的結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中有一定的靈活性。第69頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第70頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第71頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第72頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第73頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天JoachimFrank等（1995）利用一種更高分辨率的技術(shù)－冷凍電子顯微鏡技術(shù)對(duì)大腸桿菌70S核糖體進(jìn)行了更為細(xì)致的描述。他們利用計(jì)算機(jī)將4300張圖象組合起來(lái)，形成了核糖體的三維立體圖。他們還觀察到了核糖體的幾個(gè)新特征，包括30S亞基上的一個(gè)距（spur）、30S亞基頸部的一個(gè)通道（channel）以及起始于兩個(gè)亞基交界峽谷（interfacecanyon）的分叉隧道（tunnel）。

第74頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第75頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天mRNA經(jīng)由30S亞基頸部的通道形成一個(gè)U型的轉(zhuǎn)彎，在轉(zhuǎn)彎處與兩個(gè)亞基之間A位點(diǎn)和P位點(diǎn)上的tRNA發(fā)生相互作用，最后mRNA通過(guò)30S亞基的平臺(tái)和頭之間的縫隙離開(kāi)核糖體。分叉隧道的作用可能是為新生的多肽鏈提供了可選擇的離開(kāi)核糖體的通路。第76頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天最近，核糖體晶體衍射結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的研究取得了迅速的進(jìn)展。不僅表現(xiàn)在兩個(gè)亞基和整體核糖體的晶體衍射分辨率有了很大的提高，還克服了很多晶體衍射圖象的難點(diǎn)問(wèn)題。兩個(gè)亞基在原子分辨率水平上的晶體衍射圖以及整體核糖體在5.0?分辨率的分子模型都已經(jīng)發(fā)表。第77頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第78頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第79頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天大部分的核糖體蛋白，特別是那些大亞基核糖體蛋白，都有手指狀的突起伸到rRNA核心內(nèi)以穩(wěn)定rRNA的結(jié)構(gòu)。核糖體蛋白對(duì)亞基的rRNA核心起著修飾的作用。核糖體的功能中心是富含RNA的，亞基相互作用的主要位點(diǎn)也是由RNA組成，而核糖體蛋白只在一些小的和更外周的位點(diǎn)形成中發(fā)揮作用。第80頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天解碼位點(diǎn)和肽酰轉(zhuǎn)移酶中心都沒(méi)有蛋白成分?，F(xiàn)在已經(jīng)確定，距離肽酰轉(zhuǎn)移酶中心最近的核糖體蛋白沒(méi)有催化作用，它們的功能主要是維持活性位點(diǎn)的構(gòu)象。盡管核糖體的解碼和肽酰轉(zhuǎn)移酶中心以RNA為主，核糖體蛋白也發(fā)揮著非常重要的作用。沒(méi)有了蛋白成分，核糖體既不能裝配也不會(huì)發(fā)揮其功能。第81頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在翻譯的各階段均有rRNA的參與，rRNA的正確結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮催化功能所必需的。在翻譯起始過(guò)程中，rRNA的3’端直接與mRNA作用；16SrRNA在A和P位直接與反密碼子作用；23SrRNA與肽酰-tRNA的CCA端直接作用；大小亞基的結(jié)合可能涉及到