噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用

關(guān)于噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用一、噬菌體展示技術(shù)的原理LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達(dá)型第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達(dá)并展示在噬菌體表面，同時(shí)將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機(jī)的連結(jié)在一起。

第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天選擇方法：淘選（Panning)而不是篩選（Screening)第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天SolidphaseselectionwithimmunotubesBBBBBBvvImmunotubecoatedwithantigencoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenB第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天biotinantigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigen第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天BindtoStreptavidincoatedmicrotitrewells第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天Washtoremoveunboundphageparticles.第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天Eluteboundphage第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天AmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和擴(kuò)增第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

固相淘選系統(tǒng)完整細(xì)胞組織，器官常規(guī)法淘選方法正負(fù)法競(jìng)爭(zhēng)法第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天噬菌體展示技術(shù)最關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)有三：第一，淘選的高效率使得在極低的存在水平下，挑選到高親和力噬菌體成為可能；第二，所挑選到的噬菌體可在微量存在的情況下，通過感染細(xì)菌得到富集；第三：展示的多肽或蛋白質(zhì)與其包含在噬菌體內(nèi)部的基因密碼的連接，使得結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的序列分析既快速又簡(jiǎn)便。第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

噬菌體（M13,T7,T4,)

病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒，桿狀病毒）表面展示系統(tǒng)細(xì)菌（葡萄球菌，E.Coli)

酵母體外共價(jià)連接（蛋白—DNA,

蛋白—RNA)第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

診斷被動(dòng)免疫抗體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析藥物導(dǎo)航蛋白質(zhì)純化應(yīng)用范圍：第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

受體—配體信息傳遞蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)詰抗劑蛋白質(zhì)—DNA抑制劑蛋白質(zhì)—其他多肽診斷基因表達(dá)控制中和活力藥物及藥物導(dǎo)航酶及底物第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天噬菌體抗體庫的構(gòu)建第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天AntibodyIgGstructure第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天AntibodyIgGstructure第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天CLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3AntibodyIgGstructure第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcMembraneExtensionAntibodyIgGstructure第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天VHVLCLCH1CH2CH3AntibodyIgGstructure第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天VHVLCLCH1CH2CH3Fv第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天FvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

單克隆抗體噬菌體抗體

雜交瘤技術(shù)展示技術(shù)宿主細(xì)胞:雜交瘤細(xì)菌篩選范圍:~103107109時(shí)間:幾個(gè)月幾周操作:繁雜相對(duì)簡(jiǎn)單免疫:必須可避免人源抗體:+費(fèi)用:高低生產(chǎn)量:有限無限基因獲取:再克隆直接應(yīng)用前景:有限不可估

第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天二、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

抗體：抗狂犬病毒的單鏈抗體，抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此抗體可專一性殺死被HIV-1感染并表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞,中和響尾蛇毒素的單鏈抗，等等。第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天疫苗：展示在噬菌體表面的HIV-1的gp120-V3環(huán)可象天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答,等等。第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3.多肽類藥物：如一些激動(dòng)劑或拮抗劑從多肽庫中分離鑒定出來；已獲得一13肽，它能中和蛇毒α-bungarotoxin；從CX7C多肽庫中掏選到一個(gè)多肽能與Hantavirus結(jié)合，并使該病毒不能結(jié)合或感染細(xì)胞。人血管促生素（angiogenin）是一種能促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)的蛋白，用這個(gè)蛋白去淘選一個(gè)噬菌體展示多肽庫，所獲得的一個(gè)環(huán)狀8肽能與血管促生素結(jié)合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天腫瘤藥物導(dǎo)航載體：用腫瘤細(xì)胞特殊的受體蛋白從展示文庫中淘選到的多肽或單鏈抗體，可以作為抗癌藥物的定向輸送工具。一個(gè)成功的實(shí)例是：將噬菌體多肽展示庫注射入具有腫瘤的小鼠體內(nèi)，然后殺死小鼠，取出腫瘤，再將結(jié)合其上的噬菌體洗脫下來。展示在其上的多肽具有與該腫瘤的特異性親和力。將此多肽與細(xì)胞毒素doxorubicin偶聯(lián)。結(jié)果顯示，此偶聯(lián)物具有更強(qiáng)的抑制腫瘤的效果.第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天5.酶：例：堿性磷酸酶，蛋白水解酶類，等等

第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天底物與抑制劑：主要是蛋白酶的底物和其抑制劑。

第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天信息傳遞研究:

利用噬菌體展示多肽庫，發(fā)現(xiàn)了一些受體，如凝血致活酶、黑皮質(zhì)素受體、CD80和一個(gè)Hantaviral受體；受體的配體，如血管促生素、α-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折疊區(qū)域，如SH2、SH3和WW區(qū)域。從多肽庫中可分離到與天然激素相似的、與受體結(jié)合的高親和力的多肽,因此用完整細(xì)胞可以從多肽庫中找到受體的高選擇性配體。在不知道任何有關(guān)的受體和配體信息的情況下，用完整細(xì)胞和組織或動(dòng)物，可篩選到特異與靶組織結(jié)合的多肽和蛋白。第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

8.DNA結(jié)合蛋白：鋅指蛋白是一類DNA結(jié)合小肽結(jié)構(gòu)物，這些結(jié)構(gòu)含有鋅，能用于構(gòu)建一個(gè)大的蛋白區(qū)域，去識(shí)別和結(jié)合特殊的DNA序列。噬菌體展示技術(shù)也可以用于創(chuàng)造一個(gè)大的、具有識(shí)別不同DNA序列的鋅指的多肽庫。利用這個(gè)多肽庫，可以研究有關(guān)氨基酸序列與DNA結(jié)合位點(diǎn)之間的識(shí)別規(guī)則，可以通過設(shè)計(jì)鋅指多肽去控制基因的表達(dá)，比如抑制小鼠細(xì)胞系中的癌基因，也可以啟動(dòng)表達(dá)質(zhì)粒的基因，或干擾病毒感染生活周期。第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1．

9.蛋白質(zhì)組學(xué)：噬菌體展示技術(shù)作為一個(gè)多肽和蛋白質(zhì)合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到與其有特異結(jié)合力的多肽和蛋白質(zhì)，其構(gòu)建的文庫的滴度可達(dá)1012。蛋白質(zhì)組學(xué)的基本點(diǎn)就是利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)成千上萬種蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行分析。而噬菌體展示技術(shù)正好能符合這種要求。例：將噬菌體展示cDNA文庫制成蛋白點(diǎn)陣，成功的應(yīng)用于尋找與過敏癥有關(guān)的蛋白質(zhì)。第37頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

疾病的發(fā)生給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而疾病防治技術(shù)的開發(fā)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足漁業(yè)發(fā)展的要求。

我國水產(chǎn)病害的防治目前主要以抗生素及各種消毒化學(xué)品為主。

尋找新的病害防治途徑。三、噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)

第38頁,共44頁，2024年2月25日，星期天5.展望九十年代末，生物技術(shù)、基因和蛋白質(zhì)、生物信息和分子文庫系統(tǒng)的發(fā)展，大大促進(jìn)了新藥發(fā)現(xiàn)的技術(shù)革命，其中噬菌體展示技術(shù)表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性，由此而發(fā)展出的一些新方法更是大大的擴(kuò)展了新藥的發(fā)現(xiàn)和利用范圍。第39頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

隨著噬菌體展示技術(shù)在尋找新藥道路上的不斷成功，這種方法不僅限于人類醫(yī)藥的發(fā)現(xiàn)，也可以用于植物病蟲害的防治，畜牧業(yè)病害的防治以及水