赤魟腫瘤抑制基因的克隆、表達(dá)及生物活性的制作方法

赤魟腫瘤抑制基因的克隆、表達(dá)及生物活性的制作方法專利名稱：赤魟腫瘤抑制基因的克隆、表達(dá)及生物活性的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及赤魟腫瘤抑制基因的克隆、表達(dá)及生物活性。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及從赤魟尾刺cDNA表達(dá)文庫(kù)總質(zhì)粒出發(fā)，利用PCR方法篩選克隆出IPL全長(zhǎng)基因，利用基因工程的方法，在高效大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出具有生物活性的赤魟尾刺IPL蛋白以及由這種蛋白構(gòu)成的用于預(yù)防和治療人類惡性腫瘤的藥物。已有的研究表明IPL基因是一個(gè)具有PH功能域的腫瘤抑制基因和/或印跡基因。印跡基因是指在正常發(fā)育中顯示單等位基因表達(dá)的一類基因，即表達(dá)父本等位基因者則不表達(dá)母本等位基因，反之亦然。表達(dá)母本等位基因的印跡基因趨于抑制細(xì)胞增殖；而表達(dá)父本等位基因者則趨于刺激生長(zhǎng)。IPL基因表達(dá)的是母本等位基因，與其潛在的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)相一致。鼠凋亡相關(guān)基因TDAG51是IPL/TSSC3的類似物，TDAG51過(guò)表達(dá)導(dǎo)致鼠T-細(xì)胞雜交瘤FAS介導(dǎo)的凋亡。在活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的Fas表達(dá)中，IPL/TSSC3上調(diào)Fas的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)凋亡，TDAG51與TCR信號(hào)聯(lián)合起作用。IPL基因的表達(dá)具有生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，其低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)產(chǎn)生抗性。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明IPL/TSSC3/BWR1C具有一類似于血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源(pleckstrin-homology，PH)區(qū)的中心基序(motif)。象其它一些印跡基因一樣，IPL基因較小且其內(nèi)含子也小。PHdomain是一個(gè)與蛋白質(zhì)-磷脂相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的功能結(jié)構(gòu)域。赤魟IPL基因是在軟骨魚類中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，擴(kuò)充了已知印跡基因的數(shù)量及囊括的物種范圍。生物信息學(xué)分析表明赤魟CH123基因與人和小鼠同源物IPL基因的核苷酸序列相似性達(dá)78％和72％；蛋白質(zhì)序列同源性達(dá)50％和48％，而其功能域PH區(qū)基本保守。本發(fā)明提供一種如序列表中序列號(hào)碼1所示核苷酸序列的DNA。本發(fā)明提供一種如序列表中序列號(hào)碼1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供一種重組載體，該重組載體包括上述一種核苷酸序列。本發(fā)明提供一種含有上述重組載體的原核細(xì)菌。在一種實(shí)施方式中，上述原核細(xì)菌是大腸桿菌。在一種實(shí)施方式中，上述載體使是以硫氧環(huán)蛋白為融合伴體，中間插入6個(gè)His的親和標(biāo)記位點(diǎn)及蛋白酶3C識(shí)別位點(diǎn)的高效表達(dá)載體pETTRX-IPL。在一種實(shí)施方式中，上述載體使所述DNA在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)，其表達(dá)量為40-60mg/L。在一種實(shí)施方式中，上述重組載體的表達(dá)產(chǎn)物超音裂解液經(jīng)過(guò)Ni-Chelating親和柱層析，蛋白酶3C切割和凝膠過(guò)濾可得到純度在95％以上的性質(zhì)穩(wěn)定的成熟蛋白，得率為5-8mg/L。本發(fā)明還提供一種用作引物的DNA片段，該DNA片段由上述核苷酸序列的一部分序列組成。本發(fā)明還提供一種含有上述蛋白的預(yù)防或治療腫瘤疾病的藥物制劑。本發(fā)明的上述蛋白可以用于制備預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物。本發(fā)明所選擇的魟魚屬于赤魟(Dasytisakajei)，采購(gòu)自廣東省湛江水產(chǎn)品市場(chǎng)。赤魟尾刺cDNA文庫(kù)的構(gòu)建首先解剖分離到赤魟尾刺，提取總RNA；進(jìn)行第一鏈合成，LDPCRcDNA擴(kuò)增，酶切消化和柱回收cDNA構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)；隨機(jī)挑取小量文庫(kù)克隆測(cè)序獲得赤魟IPL腫瘤抑制基因的EST。然后用PCR的方法從赤魟尾刺表達(dá)文庫(kù)總質(zhì)粒中篩選克隆到IPL全長(zhǎng)基因，根據(jù)所獲得的腫瘤抑制基因IPL3’端和載體核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到目的條帶，將目的條帶連接到T-easy載體，并轉(zhuǎn)化E.coli挑選重組克隆。本發(fā)明通過(guò)對(duì)以上重組克隆進(jìn)行序列測(cè)定，克隆獲得赤魟IPL腫瘤抑制基因全長(zhǎng)基因，并通過(guò)基因工程方法表達(dá)出重組蛋白。新基因編碼136個(gè)氨基酸的成熟肽，等電點(diǎn)約為9.68，分子量約為15,690道爾頓，具有典型的IPL基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征。出現(xiàn)了PH結(jié)構(gòu)域一級(jí)結(jié)構(gòu)特征性的單一且?guī)缀醪蛔兊腃末端色氨酸(Trp，W)殘基。分子內(nèi)含有3個(gè)半胱氨酸。本發(fā)明通過(guò)一對(duì)引物的設(shè)計(jì)，將編碼赤魟IPL基因用PCR方法從T-easy載體上擴(kuò)增出來(lái)，克隆到原核融合表達(dá)載體pTRX上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(見(jiàn)圖3)。此表達(dá)載體(pTRX-IPL3C)以T7為啟動(dòng)子，采用分子伴侶TRX為融合伴體，可幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達(dá)，TRX的C端有柔鏈區(qū)和6×His結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。所設(shè)計(jì)的上游引物含有蛋白酶3C位點(diǎn)，以便外源蛋白單體的獲得。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，IPL3C融合蛋白的表達(dá)量可達(dá)到60mg/L，在Ecoli.中處于部分可溶狀態(tài)。本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組IPL蛋白的純化條件，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)Ni2+ChelatingSepharose親和色譜層析，得到純度較高的融合蛋白，融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶切割和進(jìn)一步的G50凝膠柱層析，可得到純度在95％以上的成熟重組赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL蛋白。本發(fā)明獲得的重組腫瘤抑制基因IPL蛋白是有生物活性的。本發(fā)明獲得的重組赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的人類某些惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。對(duì)重組赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL蛋白進(jìn)行的活性實(shí)驗(yàn)，利用MTT法檢測(cè)赤魟IPL重組蛋白對(duì)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)重組赤魟IPL蛋白對(duì)MGC803(胃癌)、RD(橫紋肌肉瘤)、HL60和Jurkat(白血病)等有殺傷作用，對(duì)兩個(gè)肺癌細(xì)胞則無(wú)作用。(見(jiàn)FIG)本發(fā)明利用分子生物學(xué)的方法，找到了1個(gè)新赤魟IPL腫瘤抑制基因，并采用融合表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出具有體外抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的重組赤魟IPL蛋白。本發(fā)明的含有赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL蛋白成熟肽編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pETTRX-IPL3C(構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖3)已經(jīng)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢，珞珈山，武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號(hào)為M201038，保藏日2001年10月26日。由該表達(dá)質(zhì)粒載體經(jīng)KpnI/NotI雙酶切，可得到448bp的片段，即為赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL蛋白成熟肽編碼序列(其中包含蛋白酶3C識(shí)別位點(diǎn))(酶切結(jié)果見(jiàn)圖4)本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecularcloing.ColdSpringHarborLabroratoryPress.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。圖2為赤魟尾刺IPL腫瘤抑制基因的PCR電泳結(jié)果，其中1.PCR目的條帶；2.200bpDNA標(biāo)志(Promega)。圖3為含赤魟IPL基因的重組質(zhì)粒pPETTRX-IPL3C表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖4為表示PH結(jié)構(gòu)域的示意圖。圖5為含赤魟尾刺IPL腫瘤抑制基因的BSK-IPL3C中間質(zhì)粒和pPETTRX-IPL3C表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定圖。其中，M1KbDNA梯式；欄1pPETTRX-IPL3C載體質(zhì)粒KpnI，NotI雙酶切產(chǎn)物；欄2pPETTRX-IPL3C載體質(zhì)粒；欄3BSK-IPL3C載體質(zhì)粒的KpnI，BamHI雙酶切產(chǎn)物；欄4BSK-IPL3C載體質(zhì)粒圖6為重組赤魟IPL3C蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析、酶切及分子篩層析電泳圖。圖6A表示相同收菌時(shí)間，不同IPTG誘導(dǎo)濃度的蛋白表達(dá)及可溶性，其中，C未加IPTG誘導(dǎo)的總菌體；M蛋白質(zhì)低分子標(biāo)志；0、0.01、0.1、0.25、0.5和1mMIPTG濃度梯度誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲上清。圖6B表示純化赤魟rIPL的SDS電泳，其中，C未誘導(dǎo)的總菌體；M蛋白質(zhì)低分子標(biāo)志；1表達(dá)總菌體；2超聲上清；3150mM咪唑峰；4酶切；5純化融合rIPL；6純化的rIPL。圖7表示重組赤魟rIPL蛋白親和層析圖譜。其中，BB液洗脫；CC液洗脫；DD液洗脫；EE液洗脫。圖8表示重組赤魟rIPL蛋白分子篩層析圖譜。A第1峰；B第2峰；C第3峰。圖9表示用MTT法測(cè)定重組赤魟rIPL對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增根據(jù)文庫(kù)少量克隆隨機(jī)測(cè)序結(jié)果所獲得的IPL腫瘤抑制基因的EST3’端和載體核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，T7引物5’-TAATACGACTCACTATA-3’；IPL引物5’-TCACTTCAGCCAGGTGTCA-3’。每50μlPCR反應(yīng)體積加入1μl文庫(kù)總質(zhì)粒作為模板，PGR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在850bp附近出現(xiàn)預(yù)期的特異性擴(kuò)增帶(見(jiàn)圖2)，回收此帶。實(shí)施例2重組赤魟尾刺IPL腫瘤抑制基因序列的測(cè)定和分析將回收的電泳產(chǎn)物連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑選重組克隆測(cè)序。一共測(cè)定了16個(gè)克隆，Blast同源分析表明，其中有10個(gè)是IPL腫瘤抑制基因序列，這10個(gè)IPL腫瘤抑制基因序列長(zhǎng)度都是849bp，編碼1個(gè)長(zhǎng)度為136個(gè)氨基酸的IPL蛋白，編號(hào)為Ch123。它與人和小鼠同源物IPL基因的核苷酸序列相似性達(dá)78％和72％；蛋白質(zhì)序列同源性達(dá)50％和48％但不完全相同，而其功能域PH區(qū)基本保守。在赤魟中乃首次報(bào)道，是1個(gè)新的IPL腫瘤抑制基因。利用工具軟件DNAtools對(duì)其堿基序列進(jìn)行分析，并獲得其最大讀碼框，在靠近5’端處出現(xiàn)起始密碼子ATG，并且在ATG前-3位為A，可以確認(rèn)緊跟其后出現(xiàn)的ATG為赤魟IPL基因全長(zhǎng)序列的起始密碼子；序列分析還發(fā)現(xiàn)，在3’端終止密碼子后出現(xiàn)了polyA序列，由此亦可以確認(rèn)此序列已經(jīng)終結(jié)。故根據(jù)以上的多方面分析可以判斷本實(shí)驗(yàn)所采用的赤魟IPL基因序列為全長(zhǎng)序列。另外通過(guò)Clustalw分析軟件可得如下比較結(jié)果Ch123_MRKTADSAQVMKEGVLEKRGDNLLQLWKKKYCVLTQDCLQLYPDSQKRSRSKTIH1MTAAATATVLKEGVLEKRSGGLLQLWKRKRCVLTERGLQLFEAKGTGGRPKHomMKSPDEVLREGELEKRSDSLFQLWKKKRGVLTSDRLSLFPAS-PRARPKMus_MASKIVMSSKTVKTSDEILCEGELEKRSDSLFQVWKKKRCVLTADRLRLFSG-KTSPAK.::******...*:*:**:******:..*Ch123_DLSLQEIRTVDCVERTGKYIYFTVVTTDNKEMDFRCLAEG-SWNAAITMAVIEFKNKKAITIH1ELSFARIKAVECVESTGRHIYFTLVTEGGGEIDFRCPLEDPGWNAQITLGLVKFKNQQAIHomELRFHSILKVDCVERTGKYVYFTIVTTDHKEIDFRCAGES-CWNAAIALALIDFQNRRALMus_ELFFHSILKVDCVEHTSKYVYFTIVTNYYKEIDFRCTVES-CWNAAITMALIDFQNRRAL:*:**:****.:::***:***:*****.****::.::.*:*::*:Ch123_QSFRSRQDAEMLSVGQQEKLLGRAPTIH1QTVRARQSLGTGTLVSHomQDFRSRQERTAPAAPAEDAVAAAAAAPSEPSEPSRPSPQPKPRTPMus_QDFPRYRYQRSESEMPSEPGEQSALGP*.::“*”表示相同；“:”表示差異較?。弧?”表示差異明顯；空格表示完全不同由上分析結(jié)果可以看出，本實(shí)驗(yàn)采用的赤魟IPL基因與其他物種的同源基因具有較高的同源性，具有典型的IPL基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征。其功能域PH區(qū)基本保守，出現(xiàn)了PH結(jié)構(gòu)域一級(jí)結(jié)構(gòu)特征性的單一且?guī)缀醪蛔兊腃末端色氨酸(Trp，W)殘基。經(jīng)功能域預(yù)測(cè)，赤魟IPL基因的PH結(jié)構(gòu)域從第10至105個(gè)氨基酸，位置見(jiàn)圖4。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，用普通的Taq酶會(huì)出現(xiàn)約10-4的錯(cuò)配，由于目的片段不大，PCR的循環(huán)數(shù)不超過(guò)30個(gè)，降低了錯(cuò)誤參入的概率，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，這個(gè)序列在多個(gè)克隆測(cè)序中重復(fù)出現(xiàn)，可排除錯(cuò)誤參入，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)PCR的結(jié)果有較高的可信度。實(shí)施例3重組赤魟尾刺IPL腫瘤抑制基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)赤魟IPL基因的兩端序列合成一對(duì)引物，在上游引物中引入KpnI酶切位點(diǎn)(GGTACC)、ATG起始密碼子、以及一個(gè)PrescissionProtease切割位點(diǎn)，下游引物中引入BamHI酶切位點(diǎn)(GGATCC)及終止密碼子TTA，CTA。上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpnIPrecisionProteasesiteAGGAAGACAGCGGATAGT-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTTACTAGGGAGCCCTTCCCAACA-3’BamHI以含赤魟IPL基因的pGEM-TEasy質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物PCR擴(kuò)增，得到特異擴(kuò)增的單一條帶，產(chǎn)物大小在450bp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以KpnI/BamHI雙酶切后連接到BSK載體上構(gòu)建成BSK-IPL，再以KpnI/NotI的酶切克隆到原核融合表達(dá)載體pPETTRX上?？寺≥d體和表達(dá)載體分別用KpnI/BamHI和KpnI/NotI進(jìn)行雙酶切鑒定(酶切結(jié)果見(jiàn)圖5)?？寺≥d體和表達(dá)載體中的外源基因經(jīng)測(cè)序鑒定正確。所設(shè)計(jì)的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位點(diǎn)，以便切除融合分子伴侶TRX。實(shí)施例4重組赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL蛋白融合蛋白的表達(dá)將pETTRX-IPL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)SDS電泳分析表明，菌體經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與用軟件PROTEINANALYSIS預(yù)測(cè)的理論值30.1KD相符。經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的摸索(見(jiàn)圖6菌體擴(kuò)大培養(yǎng)不同時(shí)間后誘導(dǎo)表達(dá)比較)，基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取過(guò)夜培養(yǎng)物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴(kuò)大培養(yǎng)約2h)，加入100mMIPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1mM和0.2％，25℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后離心收獲菌體。經(jīng)SDS電泳分析分析表明，在此條件下赤魟尾刺Trx-IPL融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20％以上，處于部分可溶狀態(tài)(見(jiàn)圖6)。實(shí)施例5重組赤魟尾刺腫瘤抑制基因IPL融合蛋白的純化及成熟蛋白的獲得將收獲的總菌體用TE(pH8.0)洗滌，再用Tis(50mM，pH7.0)懸浮，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+ChelatingSepharose親和色譜層析一步純化，經(jīng)SDS分析和薄層掃描分析表明融合蛋白的純度達(dá)到80％(圖6B、圖7、圖8)。以1L基因工程菌培養(yǎng)物為材料，最終獲得約60mg純化的融合蛋白。為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短對(duì)重組蛋白的處理時(shí)間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時(shí)，我們采用一步法進(jìn)行純化。根據(jù)載體質(zhì)粒pETTRX所表達(dá)的外源蛋白與Ni2+親和柱的結(jié)合能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，選用了較簡(jiǎn)化的洗脫條件50mMTris，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(B液)；50mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(C液)；100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(D液)；150mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(E液)。重組IPL蛋白在D液和E液被洗脫下來(lái)(圖7)。從SDS結(jié)果來(lái)判斷分離效果最好的部分。利用Folin-酚法測(cè)定重組PLA2的蛋白濃度，收獲濃度在0.7mg/ml以上的洗脫液，加入PrecisionProtease進(jìn)行切割，用SDS檢測(cè)酶切結(jié)果，可明顯看到16kD附近代表成熟rIPL的譜帶(見(jiàn)圖6B)。將反應(yīng)液用Ni2+ChelatingSepharose親和色譜層析柱純化(條件同前)，收獲含成熟rIPL的穿流液，并用SephadexG-50進(jìn)一步純化(洗脫液為PBS)，便得純度在95％以上的成熟重組赤魟尾刺rIPL蛋白(見(jiàn)圖8)。實(shí)驗(yàn)1MTT法測(cè)定重組赤魟rIPL蛋白對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用MTT可與活細(xì)胞的線粒體結(jié)合形成藍(lán)紫色甲月替，所以MTT的結(jié)晶量與活細(xì)胞數(shù)成正比。在10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃，5％CO2的培養(yǎng)條件下，常規(guī)培養(yǎng)MGC803(胃癌)、RD(橫紋肌肉瘤)、HL60和Jurkat(白血病)等細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化記數(shù)，接種相同數(shù)量細(xì)胞于96孔板。第二天加入按濃度梯度配制的重組赤魟rIPL蛋白樣品，每個(gè)濃度梯度三復(fù)孔，以PBS作空白對(duì)照。作用細(xì)胞48小時(shí)后，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)，37℃溫育4小時(shí)，吸棄上清，每孔加入100ul的DMSO。搖勻后，用酶聯(lián)儀在570nm處測(cè)定光吸收值，用ORIGIN5計(jì)算IC50值，并繪制曲線圖。其結(jié)果見(jiàn)表1和圖9。表1重組赤魟rIPL蛋白對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞作用OD57值的變化(MTT法)序列表1.一般信息(i)申請(qǐng)人北京博奧環(huán)宇生物技術(shù)有限公司(ii)發(fā)明名稱赤魟腫瘤抑制基因的克隆、表達(dá)及生物活性(iii)序列數(shù)目2序列號(hào)1序列長(zhǎng)度849序列類型堿基對(duì)鏈數(shù)雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀序列種類DNA起源生物赤魟(Dasytisakajei)株名大腸桿菌BL21(DE3)序列特征表示特征的記號(hào)有正確的讀碼框決定位置起始、終止密碼子決定特征的方法實(shí)驗(yàn)存在位置起始密碼子存在于第76-78位，終止密碼子494-496位GAGTCAGAGAGCTGCCGCTGTGGGAGAAGTCGGAGAGCCGGTTCTAGCTTCTTTACGGCA60AGGCTTCAACTTAAAAGTTCTTAGATGAGGAAGACAGCGGATAGTGCCCAGGTGATG118MetArgLysThrAlaAspSerAlaGlnValMetAAGGAAGGCGTGCTGGAGAAGAGGGGCGATAACCTGCTCCAGCTCTGGAAG169LysGluGlyValLeuGluLysArgGlyAspAsnLeuLeuGlnLeuTrpLysAAGAAGTACTGCGTGCTGACCCAAGACTGCCTCCAGCTCTACCCGGACTCC220LysLysTyrCysValLeuThrGlnAspCysLeuGlnLeuTyrProAspSerCAGAAGCGGTCCCGGAGCAAGGACCTGAGTCTGCAGGAGATCCGGACGGTG271GlnLysArgSerArgSerLysAspLeuSerLeuGlnGluIleArgThrValGACTGCGTGGAAAGGACGGGCAAATACATCTACTTCACCGTGGTCACCACC322AspCysValGluArgThrGlyLysTyrIleTyrPheThrValValThrThrGACAACAAAGAGATGGACTTCAGGTGCCTGGCGGAAGGCAGCTGGAACGCG373AspAsnLysGluMetAspPheArgCysLeuAlaGluGlySerTrpAsnAlaGCCATCACCATGGCTGTCATTGAGTTCAAGAACAAGAAAGCCATCCAGAGC424AlaIleThrMetAlaValIleGluPheLysAsnLysLysAlaIleGlnSerTTCCGATCGCGACAGGACGCAGAGATGCTCAGTGTGGGCCAGCAAGAGAAG475PheArgSerArgGlnAspAlaGluMetLeuSerValGlyGlnGlnGluLysCTGTTGGGAAGGGCTCCCTAGGCGTACTCCACAGGTTGGTCATGTTGATCGTGGA530LeuLeuGlyArgAlaPro*AGAAACATCAGTAAGTGAACAGTGGATGAACACACCCAGGAGATTGAGAGCCATTTGAAG590TGACTTCAGTTTCGTCCTCTGCTGCTGCTGTCAGAAGGACCCAAGCTGCTGTAATCAGCC650CCAGACATTCAGGACCTGACACCTGGCTGAAGTGAGCCTGTGGGGTTGACTGGAAATCTG710CTTTATTTATTTACCTGTTGCAGAATCCAAGA