GB-T微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定 微流控芯片法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化

微流控芯片法

High-throughputmicrobialadaptiveevolution

methodsbasedonmicrofluidicchip

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

國家市場監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

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GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定微流控芯片法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定微流控芯片法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測定步

驟和結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、扭脫甲基桿菌、谷氨酸棒狀桿菌等微生物的高通量

適應(yīng)性進(jìn)化。

2規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

GB/T27990生物芯片基本術(shù)語。

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

適應(yīng)性進(jìn)化adaptiveevolution

利用微生物繁殖迅速這一特征，在實(shí)驗(yàn)室條件下通過對(duì)微生物在某一特定環(huán)境下進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，

來模擬微生物對(duì)環(huán)境的長期適應(yīng)的過程。

3.2

微流控技術(shù)microfluidic

是一種在微米量級(jí)的微小通道中精確控制和操控微尺度流體的技術(shù)。

3.3

微液滴技術(shù)mircodroplets

通過加入適量表面活性劑，一種液體可以以極小的微滴的形式分散在另一與之不相溶的液體中，形

成高度分散的熱力學(xué)穩(wěn)定體系。

注：根據(jù)分散相和流動(dòng)相的不同，微滴可分為兩種：W/O型即以油相為連續(xù)相、水相為分散相的油包水型微滴和與

之相對(duì)的O/W型微滴。

3.4

選擇壓力selectionpressure

指外界施與的能改變適應(yīng)性進(jìn)化過程前進(jìn)方向的壓力，如溫度、溶劑耐受性、毒性底物等，亦稱脅

迫因子。

4原理

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在液滴微流控芯片上生成培養(yǎng)基包裹菌體的微液滴，以無菌的環(huán)境配以合適的溫度、溶氧，通過液

滴的運(yùn)動(dòng)往復(fù)培養(yǎng)使微生物在芯片上生長繁殖的同時(shí)維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，通過液滴分割融合的操作

單元來實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的不斷補(bǔ)充和更換，實(shí)現(xiàn)連續(xù)傳代的目的。通過上述操作，實(shí)現(xiàn)微生物的適應(yīng)性進(jìn)化，

從而獲得生長速率提高，或者對(duì)特定環(huán)境獲得耐受性提高的菌株。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?/p>

5.1水：GB/T6682二級(jí)。

5.2培養(yǎng)基

根據(jù)不同菌株的需求配置相應(yīng)的培養(yǎng)基，高壓滅菌后置于4攝氏度冰箱保存?zhèn)溆茫ü腆w培養(yǎng)基在液

體的基礎(chǔ)上加15g/L瓊脂粉）。

5.3油相

配制含10g/LSpan?80的礦物油作為液滴生成的油相，混合均勻，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

6儀器設(shè)備

6.1分析天平：精度為0.0001g和0.01g。

6.2恒溫金屬浴加熱套：溫度范圍為4-100℃，精度為0.1℃。

6.3恒流蠕動(dòng)泵：流速為1ul/min-1ml/min。

6.4光纖光譜儀：波長檢測范圍350nm-800nm。

6.5數(shù)控雕刻機(jī)：轉(zhuǎn)速24000RPM。

6.6恒溫?zé)釅簷C(jī)：60-80℃。

6.7進(jìn)樣瓶3個(gè)：容量約12ml。

7測定步驟

7.1菌體準(zhǔn)備與培養(yǎng)

7.1.1菌體準(zhǔn)備

從凍存管中蘸取一接種環(huán)菌液涂布于固體培養(yǎng)基上活化，在菌體最適生長溫度下培養(yǎng)。

7.1.2菌體培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中，酒精燈火焰附近挑取在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的單菌落放入液體培養(yǎng)基中，放入

菌體最適溫度的恒溫?fù)u床。設(shè)置合適的轉(zhuǎn)速、溫度和培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)菌體至穩(wěn)定期。

7.2進(jìn)樣瓶準(zhǔn)備

準(zhǔn)備三個(gè)進(jìn)樣瓶，編號(hào)2、4、6號(hào)進(jìn)樣瓶。2號(hào)進(jìn)樣瓶用來裝菌株懸浮液，4號(hào)和6號(hào)進(jìn)樣瓶用來

裝裝新鮮培養(yǎng)基和含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基。將準(zhǔn)備好的進(jìn)樣瓶清洗并在121℃，15min下高溫

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滅菌。

準(zhǔn)備新鮮培養(yǎng)基和含不同濃度脅迫因子的培養(yǎng)基各5-10ml。準(zhǔn)備用無菌培養(yǎng)基稀釋至2%的生長到

穩(wěn)定期的菌3-5ml，用無菌針管先向三個(gè)進(jìn)樣瓶側(cè)管注入1-2ml油相。注射完畢旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣瓶，讓油相浸

濕整個(gè)進(jìn)樣瓶內(nèi)部，以同樣方式注入菌液約3-4mL或培養(yǎng)基6-8ml，最后注入油將進(jìn)樣瓶裝滿，拔出進(jìn)

樣針及其連接頭。

7.3微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片制作

芯片材料使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。使用Auto-CAD軟件作出芯片管道的結(jié)構(gòu)圖，按照芯

片設(shè)計(jì)圖使用雕刻芯片管道并鉆孔，同時(shí)額外刻制一塊僅打磨平面、無管道的芯片。使用大量清水和

75%乙醇沖洗雕刻好的兩塊芯片，保證管道內(nèi)無毛刺。

將兩塊芯片對(duì)齊貼合并將75%乙醇通入使之充滿管道與兩塊芯片的接觸面，使用恒溫?zé)釅簷C(jī)將芯

片在65-75°C下壓合2min。如壓合效果不理想則再次通入75%乙醇，適當(dāng)提高壓合溫度和壓合時(shí)間，

重復(fù)壓合。待壓合后的芯片冷卻降溫后，使用快速粘結(jié)劑將外徑為700μm的金屬管插入芯片上的孔內(nèi)

并粘接固定。待粘結(jié)劑固化后芯片即可使用（使用前需用油相在低流速下潤洗管道）。

7.4微生物連續(xù)培養(yǎng)微流控平臺(tái)的搭建

芯片C1和C3口外連兩套約1.5m長管路，為菌株主培養(yǎng)通道。C1口外長管路上設(shè)有光纖光譜儀

檢測區(qū)域，可持續(xù)在線檢測獲得液滴內(nèi)菌體的OD值。C5口的管道用于補(bǔ)油，以控制兩相長度。C2口

外的進(jìn)樣瓶用于菌株懸浮液進(jìn)樣，C4和C6外的兩個(gè)進(jìn)樣瓶分別裝有新鮮培養(yǎng)基和含有一定濃度脅迫

因子的培養(yǎng)基。進(jìn)樣瓶選用具有頂管和側(cè)管的液壓瓶，其中頂管在液壓瓶的中心，與液壓瓶的頂部恰好

連通；側(cè)管則較靠近瓶壁，貫穿液壓瓶頂部，直達(dá)液壓瓶底部。頂管與泵連接，側(cè)管與芯片連接。CF

口連接的電磁閥控制著系統(tǒng)總出口，可排出廢液至廢液瓶。除CF口外，每個(gè)管道上都接有一個(gè)恒流蠕

動(dòng)泵作為注射泵。1-6號(hào)注射泵的一端接入礦物油進(jìn)樣瓶，用于平臺(tái)各管道內(nèi)的油相進(jìn)樣。選用具有三

通管道的注射泵，其具有三種狀態(tài)：當(dāng)處于O狀態(tài)時(shí)，注射泵的注射器和礦物油進(jìn)樣瓶連通，注射器

可吸取油；當(dāng)處于I狀態(tài)時(shí)，注射泵的注射器和芯片連通，注射器可推出油；當(dāng)處于B狀態(tài)時(shí)，芯片和

礦物油進(jìn)樣瓶連通，泵對(duì)應(yīng)的芯片通道口打開，通道處于通路狀態(tài)。

整個(gè)平臺(tái)可裝進(jìn)一個(gè)密閉箱體，以便于控制培養(yǎng)溫度。3個(gè)進(jìn)樣瓶置于恒溫金屬浴加熱套中，芯片

和管道置于恒溫金屬浴加熱套上，以便使樣品和液滴的溫度盡快到達(dá)培養(yǎng)溫度。使用空氣加熱器來控制

環(huán)境溫度，減少液滴與環(huán)境的換熱，更加準(zhǔn)確地控制溫度。配置溫度計(jì)來讀取箱體內(nèi)的溫度。

7.5液滴識(shí)別和編號(hào)

在生成液滴后，可通過油水檢測激光來識(shí)別液滴。識(shí)別的原理主要是基于油相和水相的激光折射率

之間的差異。當(dāng)油相經(jīng)過芯片上的激光檢測區(qū)時(shí)，油水檢測激光將讀取到一個(gè)較低的光壓值（一般低于

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1）；當(dāng)液滴經(jīng)過芯片上的激光檢測區(qū)時(shí)，油水檢測激光將讀取到一個(gè)較高的光壓值（一般高于3.2）。通

過光壓值的大小對(duì)比可識(shí)別出液滴。由于激光是連續(xù)檢測的，因此可以對(duì)液滴進(jìn)行編號(hào)，并測出液滴的

長度。

7.6液滴生成

所有泵的初始狀態(tài)為O狀態(tài)且泵的注射器都吸滿油。將3號(hào)泵切換至B狀態(tài)，2號(hào)泵切換至I狀態(tài)

推出菌株懸浮液至通道交叉口處，然后將1號(hào)泵切換至I狀態(tài)推出油相，利用油相的剪切力來阻斷菌株

懸浮液（即水相）而得到油包水型的液滴。利用2號(hào)泵和1號(hào)泵交替推出水相和油相，通過控制泵推出

兩相的時(shí)間和速度，可控制液滴的長度，實(shí)現(xiàn)液滴的生成。

7.7菌體芯片培養(yǎng)和生長狀況監(jiān)測

在生成液滴后，將2號(hào)泵切換至O狀態(tài)?？啥x液滴在芯片主通路中的正反向運(yùn)動(dòng)。正向運(yùn)動(dòng)指

的是3號(hào)泵處于B狀態(tài)，1號(hào)泵推出油相使液滴在主通路中定向運(yùn)動(dòng)；反向運(yùn)動(dòng)指的是1號(hào)泵處于B

狀態(tài)，3號(hào)泵推出油相使液滴在主通路中定向運(yùn)動(dòng)。利用1、3號(hào)泵的交替切換可以使液滴在主管道內(nèi)

進(jìn)行正反向的往復(fù)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行液滴往復(fù)運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)過程。在往復(fù)運(yùn)動(dòng)過程中液滴會(huì)發(fā)生一定的自旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，

以達(dá)到促進(jìn)微滴內(nèi)部混合的目的。液滴往復(fù)運(yùn)動(dòng)的單程時(shí)間和往復(fù)運(yùn)動(dòng)的流量均可使用蠕動(dòng)泵設(shè)定。

液滴在每次定向運(yùn)動(dòng)過程中，都可以通過激光檢測區(qū)進(jìn)行識(shí)別和編號(hào)。而液滴在每次反向運(yùn)動(dòng)時(shí)，可以

對(duì)液滴之間的距離進(jìn)行校正。當(dāng)兩個(gè)液滴之間的距離短于設(shè)定距離時(shí)，可將5號(hào)泵切換至I狀態(tài)進(jìn)行補(bǔ)

油；當(dāng)兩個(gè)液滴之間的距離長于設(shè)定距離時(shí)，可將5號(hào)泵切換至B狀態(tài)，3號(hào)泵將多余的油從C5口推

出。對(duì)液滴距離進(jìn)行校正的好處在于可以防止液滴在運(yùn)行過程中自行融合，維持液滴運(yùn)行的穩(wěn)定性。

液滴在進(jìn)行反向運(yùn)動(dòng)經(jīng)過光纖光譜儀檢測區(qū)域時(shí)，可進(jìn)行菌體濃度的檢測。檢測區(qū)域兩端分別連接固定

有光纖光譜儀的光源光纖與接收光纖，液滴經(jīng)過檢測區(qū)域時(shí)會(huì)吸收掉部分光纖光譜儀光源發(fā)出的光，剩

余的光進(jìn)入接收光纖。根據(jù)標(biāo)定的空白樣品吸收光強(qiáng)度可計(jì)算出該液滴的吸光度數(shù)值并實(shí)時(shí)反饋到與光

纖光譜儀配套的計(jì)算機(jī)中。根據(jù)波長600nm處液滴的吸光度可折算出液滴內(nèi)菌體的濃度，并以此評(píng)價(jià)

菌體的生長狀態(tài)。

7.8液滴分割和融合

在液滴進(jìn)行正向運(yùn)動(dòng)時(shí)可進(jìn)行液滴的分割和融合操作。當(dāng)檢測到液滴后，1號(hào)泵將液滴推至C5補(bǔ)

油通道和主通道的交界處，然后將5號(hào)泵切換至I狀態(tài)，從垂直方向注入油相，利用油相剪切力可將液

滴進(jìn)行分割（該過程可用PLC控制器控制油相注入的時(shí)間和速度，實(shí)現(xiàn)液滴的定量分割）。被分割開的

部分液滴可以通過打開電磁閥而被排到廢液瓶里，剩下的部分液滴可進(jìn)行后續(xù)的液滴融合操作。

施加電場可以促進(jìn)液滴融合。當(dāng)施加特定電場時(shí)，電場會(huì)使得液滴表面的表面活性劑不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致

液滴融合。在分割完液滴后，通過4或6號(hào)泵可以把新鮮培養(yǎng)基或含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基推至

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主通道處，然后給電極通電產(chǎn)生電場，以促進(jìn)新鮮培養(yǎng)基或含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基和剩下的部

分液滴進(jìn)行融合。該過程可用PLC控制器控制新鮮培養(yǎng)基和含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基的體積和

融合比例，實(shí)現(xiàn)含有不同濃度脅迫因子的培養(yǎng)基與剩余液滴的融合操作