微生物無菌操作技術(shù)

關(guān)于微生物無菌操作技術(shù)微生物接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程。微生物接種技術(shù)是進(jìn)行微生物實驗和相關(guān)研究的基本操作技能。無菌技術(shù)：指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。無菌操作是微生物接種技術(shù)的關(guān)鍵。無菌操作主要目的：（1）保證實驗操作中不被環(huán)境中微生物污染；（2）防止微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天微生物接種流程一、實驗材料的準(zhǔn)備工作（1）培養(yǎng)基的配制和相關(guān)器具的準(zhǔn)備（2）滅菌和消毒二、無菌操作（1）接種前的準(zhǔn)備工作（2）接種第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天一、實驗材料的準(zhǔn)備工作（1）培養(yǎng)基的配制和相關(guān)器具的準(zhǔn)備1、培養(yǎng)基的配置2、接種工具的準(zhǔn)備：常用的接種工具有接種環(huán)、接種針和涂布棒。其中最常用的接種工具或移植工具是接種環(huán)。3、其他器具的準(zhǔn)備第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（2）滅菌和消毒消毒：用較溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體上絕大多數(shù)微生物的措施，實際上是部分滅菌。例如，酒精擦拭。滅菌：采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外所有微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過濾除菌紫外線殺菌化學(xué)藥劑殺菌第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天其中高壓蒸汽滅菌是微生物學(xué)研究和教學(xué)中應(yīng)用最廣泛、效果最好的濕熱滅菌方法。滅菌原理：將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升，從而溫度也隨之上升到100℃以上。為達(dá)到良好的滅菌效果，一般要求溫度應(yīng)達(dá)到121℃（壓力為0.1MPa）時間維持15到30分鐘。也可以采用在較低的溫度（115℃，壓力為0.075MPa）下維持35分鐘的方法。第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天注意事項：①堆放滅菌物品時，嚴(yán)禁堵塞安全閥和放氣閥的出氣孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥和放氣閥因出氣堵塞不能工作，造成事故。②滅菌液體時，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過3/4體積為好，瓶口選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞。③滅菌液體結(jié)束時，不準(zhǔn)立即釋放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可放余汽。④對不同類型、不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免造成損失。⑤滅菌終了時，若壓力表指針已回復(fù)零位，而蓋不易開啟時，則可將放氣閥摘子置于放氣方汽。使外界空氣進(jìn)入滅菌器內(nèi)，真空消除后，蓋即可開啟。⑥高壓滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，高壓滅菌鍋內(nèi)冷空氣排除不干凈，將達(dá)不到滅菌所需的溫度。第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天二、無菌操作（1）接種前的準(zhǔn)備工作1、儀器①超凈工作臺超凈工作臺是能將工作區(qū)已被污染的空氣通過專門的過濾通道人為地控制排放，為實驗室工作提供無菌操作環(huán)境的設(shè)施，以保護(hù)實驗免受外部環(huán)境的影響，同時為外部環(huán)境提供某些程度的保護(hù)以防污染，是一種安全的微生物專用潔凈工作臺。原理：超凈工作臺的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，通過風(fēng)機(jī)將空氣吸入預(yù)過濾器，經(jīng)由靜壓箱進(jìn)入高效過濾器過濾，將過濾后的空氣以垂直或水平氣流的狀態(tài)送出，潔凈空氣(進(jìn)濾空氣)按設(shè)定的方向流動而形成的。使操作區(qū)域達(dá)到所需的潔凈度。第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天超凈工作臺的使用及注意事項①使用前30到60分鐘用75%的酒精或0.5%過氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺面，打開紫外燈照射30min；②使用前10分鐘將風(fēng)機(jī)啟動，調(diào)整風(fēng)量，工作時關(guān)閉殺菌燈；③使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布檫拭；④請保持超凈臺整潔、干燥，不要堆積雜物，禁止存放無關(guān)的物品，以保持工作區(qū)的潔凈氣流不受干擾；⑤禁止在工作臺面上記錄書寫，工作時應(yīng)盡量避免作明顯干擾氣流的動作；⑥禁止在預(yù)過濾器進(jìn)風(fēng)口部位放置物品，以免擋住進(jìn)風(fēng)口造成進(jìn)風(fēng)量減少，降低凈化能力；⑦使用完畢后，用消毒液擦拭工作臺面，關(guān)閉送風(fēng)機(jī)，重新開啟紫外燈照射15min，最后關(guān)閉電源；第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天②生物安全柜生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實驗材料時，用來保護(hù)操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天生物安全柜使用規(guī)程①操作前應(yīng)將本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免雙臂頻繁穿過氣幕破壞氣流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。②打開風(fēng)機(jī)5～10分鐘，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進(jìn)行實驗操作。將雙臂緩緩伸入安全柜內(nèi)，至少靜止1分鐘，使柜內(nèi)氣流穩(wěn)定后再進(jìn)行操作。③安全柜內(nèi)不放與本次實驗無關(guān)的物品。柜內(nèi)物品擺放應(yīng)做到清潔區(qū)、半污染區(qū)與污染區(qū)基本分開，操作過程中物品取用方便，且三區(qū)之間無交叉。物品應(yīng)盡量靠后放置，但不得擋住氣道口，以免干擾氣流正常流動。④操作時應(yīng)按照從清潔區(qū)到污染區(qū)進(jìn)行，以避免交叉污染。為防可能濺出的液滴，可在臺面上鋪一用消毒劑浸泡過的毛巾或紗布，但不能覆蓋住安全柜格柵。⑤柜內(nèi)操作期間，嚴(yán)禁使用酒精燈等明火，以避免產(chǎn)生的熱量產(chǎn)生氣流，干擾柜內(nèi)氣流穩(wěn)定；且明火可能損壞HEPA濾器。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天⑥工作時盡量減少身后人員走動以及開關(guān)房門，以防止安全柜內(nèi)氣流不穩(wěn)定。⑦在實驗操作時，不可打開玻璃視窗，應(yīng)保證操作者臉部在工作窗口之上。在柜內(nèi)操作時動作應(yīng)輕柔、舒緩，防止影響柜內(nèi)氣流。⑧柜內(nèi)使用的物品應(yīng)在消毒后再取出，以防止將病原微生物帶出而污染環(huán)境。⑨工作完全后，關(guān)閉玻璃窗，保持風(fēng)機(jī)繼續(xù)運轉(zhuǎn)10～15分鐘，同時打開紫外燈，照射30分鐘。⑩安全柜應(yīng)定期進(jìn)行清潔消毒，柜內(nèi)臺面污染物可在工作完成且紫外燈消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜體外表面則應(yīng)每天用1%的84消毒液擦拭。第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天超凈工作臺（cleanbench）與生物安全柜（BiosafetyCabinet）不同。超凈工作臺只能保護(hù)在工作臺內(nèi)操作的試劑等不受污染，并不保護(hù)工作人員，而生物安全柜是負(fù)壓系統(tǒng)，能有效保護(hù)工作人員。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天2、無菌室的操作規(guī)則①將所有的實驗器材和用品一次性全部放入無菌室（如同時放入培養(yǎng)基則需用牛皮紙遮蓋）。應(yīng)盡量避免在操作過程中進(jìn)出無菌室或傳遞物品。操作前先打開紫外燈照射半個小時，關(guān)閉紫外燈后，在開始工作。②進(jìn)入緩沖間后，應(yīng)換好工作服、鞋、帽、戴上口罩，將手用消毒液清洗后，在進(jìn)入工作間。③操作時，嚴(yán)格按照無菌操作法進(jìn)行操作，廢物應(yīng)丟入廢物桶內(nèi)。④工作后應(yīng)將臺面收拾干凈，取出培養(yǎng)物品及廢物桶，用消毒液清潔，再打開紫外燈照射半個小時。第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天3、無菌操作要求①在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；②使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放；③在火焰上方操作；④接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；⑤在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)；⑥不能用嘴直接吸吹吸管；⑦帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒；⑧操作時禁止再培養(yǎng)物上方移動手臂；第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（2）接種1、接種的一般流程接種工具滅菌接種工具冷卻沾取標(biāo)本接種接種工具滅菌防止污染標(biāo)本防止污染環(huán)境第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天2、到平板第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天3、斜面接種技術(shù)斜面接種是從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種方法。用于好氣性微生物的接種。具體操作：①貼標(biāo)簽：接種前在試管上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等，貼在距試管口約2到3厘米處，也可使用記號筆標(biāo)記。②點燃酒精燈。③接種：1）手持試管將菌種管和待接斜面的兩支試管用大姆指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于水平位置。第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天②旋松管塞先用右手松動試管塞，以便接種時拔出③接種環(huán)灼燒滅菌右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)端灼燒滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分均灼燒滅菌，重復(fù)此操作，再灼燒一次④拔管塞用右手的無名指、小指和手掌邊先后取下菌種試管和待接試管的試管塞，然后讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒得過燙)⑤取菌待接種環(huán)冷卻后，輕沾取少量菌體或胞子，然后將接種環(huán)移出菌種試管，注意不要使接種環(huán)碰到管壁，取出后帶菌接種環(huán)不可通過火焰。第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天⑥接種在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面培養(yǎng)基底部向上作“Z”形來回密集劃線，勿劃破培養(yǎng)基。有時也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長特點。第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天⑦塞管塞取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將試管塞旋上。⑧將接種環(huán)灼燒滅菌。斜面接種示意圖第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天4、液體接種具體操作：與斜面接種基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上試管塞再輕輕搖勻。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時，一般用移液管或滴管接種。第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天5、劃線接種目的：使混合的細(xì)菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌、活菌計數(shù)。方法：①分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本②連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本第23頁,共26頁，2024年2月25日，星期天分區(qū)劃線法連續(xù)劃線法第24頁,共26頁，2024年2月25日，星期天6、穿刺接種穿刺接種技術(shù)是一種用接種針從菌