培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌

關(guān)于培養(yǎng)基的制備與高壓滅菌微生物基礎(chǔ)實驗注意事項1、提高安全意識，正確操作儀器；2、培養(yǎng)無菌操作的觀念；3、自覺清洗器皿；4、注重保持環(huán)境衛(wèi)生和實驗室秩序；

第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的制備與滅菌

一、目的：

1、學(xué)習(xí)一般培養(yǎng)基的制備方法；

2、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用的滅菌方法。第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

二、原理

1、培養(yǎng)基(culturemedium)：培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工的方法配制而成的一種基質(zhì)。

培養(yǎng)基的種類：根據(jù)培養(yǎng)基的成分可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基；按物理性狀不同，可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

⑴天然培養(yǎng)基：主要成分是天然有機物質(zhì)，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。適用于生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)微生物。

⑵合成培養(yǎng)基：成分明確的化學(xué)藥品配制而成的培養(yǎng)基。如：高氏一號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等。一般適用于在實驗室范圍內(nèi)研究微生物的形態(tài)、營養(yǎng)代謝、分類鑒定、生物測定、菌種選育和遺傳分析等工作。

⑶半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎(chǔ)上，適當補充一些成分已知的化學(xué)藥品所配制的培養(yǎng)基。具有廣泛的應(yīng)用，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，適合很多霉菌的生長。第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

⑴液體培養(yǎng)基：配好后成為液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。如糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基等。廣泛用于理論研究和大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵。

⑵固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑形成的固態(tài)培養(yǎng)基。常用凝固劑有瓊脂、明膠、硅膠。硅膠用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基；對于其他多數(shù)微生物來講，瓊脂最為合適，一般加入1.5-2.5%，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、菌種保藏等。⑶半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即配成為半固體培養(yǎng)基，如，加入0.2-0.7%瓊脂作為凝固劑。用來觀察細菌運動特征、鑒定菌種、菌種保藏和噬菌體的效價滴定等。第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途分類：

⑴基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，也是作為某些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。

⑵加富培養(yǎng)基：是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血、血清、動物組織提取液或植物組織提取液，主要用于培養(yǎng)某些對營養(yǎng)要求較為苛刻的微生物。第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

⑶選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?、化學(xué)條件的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。①根據(jù)某些微生物對碳、氮源的特殊要求來設(shè)計選擇性培養(yǎng)基，可以分離到能分解某些物質(zhì)的微生物。②在培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長繁殖。如在分離放線菌時，在培養(yǎng)基中添加10%的酚數(shù)滴可抑制細菌和霉菌的生長。

⑷鑒別培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種化合物或化學(xué)試劑，使培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物與該化合物或化學(xué)試劑發(fā)生明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將此種微生物與其他種微生物區(qū)別開來，如伊紅美藍培養(yǎng)基。第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天2、滅菌：消毒與滅菌是兩個不同的概念。

消毒：一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，而不能殺死全部芽孢，因此，消毒對微生物的殺滅是不徹底的，而且往往只能作用到物體表面，只能作為一般的衛(wèi)生措施。如使用酒精、84消毒液浸泡或煮沸法對器械的表面消毒處理，用紫外燈對房間進行照射等。

滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體、芽孢和孢子，因此，滅菌后的物品不再帶有活體微生物。滅菌的方法很多，如加熱(干熱或濕熱)、過濾等。第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天⑴干熱法滅菌：a)

火焰燒灼：適用于接種環(huán)、接種針、鑷子等金屬用具，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上短暫燒灼滅菌。

b)熱空氣滅菌：使用電熱干燥箱，借助熱空氣在160-1700C下保溫2小時進行滅菌，此法適用于玻璃器皿（如吸管和培養(yǎng)皿）等的滅菌，對帶膠皮的器物或培養(yǎng)基不適用。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

⑵濕熱滅菌：a)高壓蒸汽滅菌

高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15—30分鐘進行滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基等的滅菌。

b)間歇滅菌法

少數(shù)培養(yǎng)基，例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等，高溫高壓滅菌易被破壞，適用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行滅菌，將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內(nèi)，每天加熱1000C，30分鐘，連續(xù)3天，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物去出放室溫下18-24小時，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱1000C，30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

三、材料：

1、藥品：NaCl蛋白胨牛肉膏可溶性淀粉K2HPO4HClNaOH瓊脂葡萄糖蔗糖Na2SO4

黃豆芽馬鈴薯伊紅美藍等。

2、器材：臺秤三角瓶試管漏斗電爐搪瓷杯（鋁鍋）試管架玻棒滴管稱量紙pH試紙棉花紗布牛皮紙棉線滅菌鍋干燥箱等。第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

四、方法及步驟：

1、培養(yǎng)基的配制一般可分為稱量、溶化、pH調(diào)節(jié)、過濾和分裝等步驟

⑴稱量：按照培養(yǎng)基配方，稱取各種成分；⑵溶化：在容器中先加入所需蒸餾水水量的一部分，依次將各成分加入，使全部溶解，最后補足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物質(zhì)配制培養(yǎng)基時，需加熱溶解，并補足水分。配制固體培養(yǎng)基時，先將上述配好的液體培養(yǎng)基加熱到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱到瓊脂完全熔化，在加熱過程中要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

⑶矯正pH值：初配制好的培養(yǎng)基，往往不能符合所需求的pH值，故必須矯正，用精密pH試紙，以1NHCl或1NNaOH調(diào)節(jié)至所需要的pH值。

⑷過濾：用濾紙、棉花或雙層紗布過濾。

⑸分裝：將制成的培養(yǎng)基分裝于三角瓶或試管內(nèi)。第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天馬鈴薯糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)

成分：馬鈴薯200g

蔗糖20g

瓊脂25g

水補足1000ml

方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，放入搪瓷杯中，摻適量水加熱煮沸30分鐘（注意不時用玻棒攪拌，避免糊底），用雙層紗布濾去薯塊，在薯汁中加入瓊脂，加熱熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水補足體積，趁熱分裝到三角瓶中，121℃滅菌20min。

注：無須調(diào)pH值，保持自然的酸性。第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)

成分1：蛋白胨10gNaCl5g

乳糖4g

瓊脂25g蒸餾水1000mlpH7.6

成分2：2%伊紅水溶液2ml，0.5%美藍水溶液1ml

方法：先配成分1，調(diào)好pH值后才可加入成分2，混勻，趁熱分裝到三角瓶中，115℃滅菌20min。第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天3倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基

成分1：蛋白胨30g

牛肉膏9g

乳糖15gNaCl

15g蒸餾水

補足1000mlpH7.2

成分2：1.6%溴鉀酚紫乙醇溶液3ml

方法：先配成分1，調(diào)好pH值后才可加入成分2，混勻，分裝到三角瓶及大試管中，并加入倒置的事先充滿該培養(yǎng)液的杜氏管（勿留氣泡），封口后115℃滅菌20min。第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

2、滅菌：⑴干熱滅菌步驟：

①將要滅菌的器皿（培養(yǎng)皿、吸管等）包扎好，放入恒溫干燥箱內(nèi)。②接通電源，打開開關(guān)；旋動恒溫調(diào)節(jié)器至1400C，當達到此溫度時，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動控制，保持恒溫兩小時。③兩小時后，關(guān)掉電源，當溫度降至600C以下后，才可打開箱門，取出滅菌物品。第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天（2）高壓蒸汽滅菌

原理：在密閉容器中加熱形成的蒸汽不斷堆積，使蒸汽壓力升高，溫度也相應(yīng)升高，超過水的沸點。利用過熱的蒸汽來使細菌及其耐熱芽孢蛋白質(zhì)凝固變性，以致失去生命力，從而達到徹底滅菌的效果。高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持15~30分鐘進行滅菌，就可殺死一切微生物細胞及其芽孢或孢子。滅菌對象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各種不因高溫處理而變質(zhì)的物品材料。但對不耐高溫、高壓的溶液或培養(yǎng)基不宜用此種方法。第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天手提式蒸汽滅菌鍋立式蒸汽滅菌鍋（電加熱、自動或半自動）臥式蒸汽滅菌鍋第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌鍋的使用：

①鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三腳擱架相平為宜。②把要滅菌的材料裝入鍋內(nèi)，注意不要放得太擠，防礙蒸汽流通，影響滅菌效果。③蓋好滅菌鍋鍋蓋，按對角線形式均勻擰緊鍋蓋上的螺栓，螺栓松緊一致，以免漏氣。④打開電源，開啟排汽閥，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。⑤待冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排汽開關(guān)。讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時?？刂茻嵩矗S持壓力至所需時間。本實驗根據(jù)培養(yǎng)基不同，分別采用：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持20分鐘；0.7kg/cm2（10磅/英寸2），115.60C保持20分鐘。第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

⑥滅菌所需時間到后，關(guān)閉熱源。⑦讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力降至“0”時，打開排汽閥。⑧打開滅菌鍋蓋，取出已滅菌的物品及培養(yǎng)基。第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天五、培養(yǎng)基的配制及器材準備：

1：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2000ml，分裝于16個250ml三角瓶；2：配牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基500ml，分裝于100支試管；3：高氏1號固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于8個250ml三角瓶；4：淀粉固體培養(yǎng)基1000ml，分裝于8個250ml三角瓶；5：馬鈴薯固體培養(yǎng)基2000ml，分裝于16個250ml三角瓶；6：豆芽汁培養(yǎng)基1000ml,分裝于8個250ml三角瓶+20支試管；7：無氮培養(yǎng)基50